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一种简单有效的降低 RNA 3'端异质性的转录方法

相关实验:一种简单有效的降低 RNA 3' 端异质性的转录方法

最新修订时间:

材料与仪器

8umol L 顶链 8umol L 底链 5'末端 2 个核苻酸进行甲氧基修饰
20X 缓冲液 NTP 混合物 lmol LNaOH 聚乙二醇 8000 0.5mol LMgCl2 1mol L 谷氨酸钠 T7RNA 聚合酶 载样缓冲液

步骤

一材料与设备

1)8umol/L 顶链

2)8umol/L 底链,5'末端 2 个核苻酸进行甲氧基修饰

3)20X 缓冲液:800 mmol/LNaCl.20 mmol/L 精胺,100 mmol/LDTT,0.2%TritonX-100(pH8.l)

4)NTP 混合物,各 80mol/L, 用 1mol/LNaOH 调 PH8.1

5)lmol/LNaOH。

6) 聚乙二醇 8000,400 mg/ml。

7)0.5mol/LMgCl2

8)1mol/L 谷氨酸钠 (pH8.l)

9)T7 RNA 聚合酶。

10) 载样缓冲液:8mol/L 尿素,lmmol/LEDTA,0,1% 一甲苯青 FF,0.1% 溴酚蓝


二、操作方法

1) 在灭菌微量离心管中混合下列物质:

8umol/L 顶链 (终浓度 400nmol/L)                             1ul

8umol/L 底链(5'端 2 个核苷                                 1ul

酸甲氧基修饰,终浓度 400nmol/L)

20X 缓冲液                                                              2ul

NTP 混合物                                                            2ul

聚乙二醇 8000                                                        5ul

0.5mol/LMgCl                                                   1.12ul

1mol/L 谷氨酸钠                                                     1ul

T7RNA 聚合酶                                                        1ul

加无核酸酶的水至总体积为                                    20ul

2) 于 37℃ 反应 lh。

3) 加载样液,变件聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化回收,保存于一 20℃

注意事项

1) 标准体系是 20ul 但每种成分可按比例放大体系,以增加转录物的量

2) 一般来说,NTP 的摩尔数与 Mg2+的庠尔数比例为 1:1.75, 但此比例可能需要优化。

3)对于某些模板,谷氨酸钠可以提尚转录产物的回收率。

来源:丁香实验

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