棉铃虫病毒的扩增及分离纯化
互联网
791
一、目的与任务
1. 学习病毒的分离纯化方法
2. 通过病毒的分离纯化进一步理解病毒与宿主的相互关系
二、基本原理
杆状病毒是一类寄生于节肢动物的杆状的病原微生物。其宿主主要是鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫, 还有一些杆状病毒可以感染甲壳纲的节肢生物。杆状病毒常常包埋于由蛋白质组成的包含体基质(polyhedron/granulin)中。根据包含体的形态和病原微生物在(昆虫)细胞中的分布, 可以将杆状病毒划分为核多角体病毒属(NPV)和颗粒体病毒属(GV)两个属。其中核多角体病毒属又根据病毒粒子包膜中的粒子数目不同而划分为多粒包埋型核多角体病毒(MNPV)和单粒包埋型核多角体病毒(SNPV),
杆状病毒在其生活史中具有两种形态, 出芽病毒粒子BV(budded virus)和包埋型病毒粒子ODV(occlusion derived virus)。ODV 被包埋于由多角体蛋白质组成的包含体中, 包含体的外侧还有多角体囊膜。多角体在环境中非常稳定, 能对病毒粒子起到保护作用。当多角体被昆虫幼虫吞食后, 在虫体中肠的偏碱性环境中能迅速溶解释放出病毒粒子, 病毒粒子便由中肠开始感染虫体。ODV 对于杆状病毒在环境中的传播起重要作用。BV 使病毒感染细胞的早期形成的出芽病毒, 它在从细胞膜上出芽时获得了一种病毒编码的囊膜蛋白, 此囊膜蛋白可以与细胞表面的特定受体相结合, 对病毒粒子在虫体内的传播和体外增殖体系的细胞之间的传播中起重要作用。
杆状病毒的BV 和ODV 形态除了以上的不同之外, 病毒粒子及其囊膜的组成基本是相同的。
ODV 只能在宿主个体之间的传播期起作用，BV 在细胞之间的传播起作用。因此不同的病毒形式应
该采用相应的感染方法。
感染后的棉铃虫尸体体内充满病毒，根据病毒和宿主组织碎片的特性差异，则可以采用差速离
心的方法进行病毒的分离纯化。
二、实验材料：棉铃虫 及棉铃虫核型多角体病毒 棉铃虫饲养人工饲料（配方为：黄豆粉80g, 小麦粉80g, 酵母粉16g, 琼脂14g, 维生素C 20 片, 维生素B 15 片, 山梨酸1g, 苯甲酸钠1g, 冰乙酸5ml, 尼泊尔金乙酯2g, Benlate 0,05~0.1g, 加水至1L。）镊子、 二十四孔 细胞培养 板、橡皮筋、培养皿、卫生纸、纱布、1.5mL 离心管血球计数板
三、实验 仪器 ：
普通光学显微镜 生物 化学培养箱
四、实验内容急操作步骤：
1. 病毒的稀释：将病毒原液按照10X 稀释法稀释到合适的浓度。
2. 显微计数：取一块干净的载玻片（在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物应进行，清洗后才能使用）将100μl 病毒稀释液滴于血球记数版的计数室内进行镜检。
3. 口服感染和注射感染：A 口服感染：将饲养棉铃虫幼虫的24 孔板在紫外灯下灭菌2h, 每个孔中放入一块饲料, 饲料的大小以能让4 龄幼虫一夜吃完为宜；在其上滴加1×106 个棉铃虫病毒多角体；在每个孔中加入1 头3 龄未—4 龄初的棉铃虫幼虫, 盖上盖子, 盖子与底板之间加上卫生纸防止幼虫逃逸, 放入28℃温箱培养, 当食物吃完后应补加饲料培养基；大约4d 后, 棉铃虫幼虫开始液化, 收集棉铃虫的虫尸做进一步的纯化。B 注射感染：取3 龄末棉铃虫幼虫放于冰上；戴上手套, 用50μl 微量注射器；将10μl 含BV 的溶液注射于幼虫腹部, 两侧腹趾之间的皮下。
4. 病毒感染后，棉铃虫宿主病理过程的外部症状观察：：病毒感染昆虫后，表现出病毒感染的特有的外部症状，这些外部症状和虫龄、感染剂量、营养、温度、病毒与宿主的亲和性、幼虫的体质等许多因素有关。得病后的宿主幼虫动作迟钝，食欲减退或停止取食，虫体肿胀，表皮具光泽，幼虫死后表皮变得十分脆弱，轻触即破，流出脓状液体。。
5. 病毒的收集：在幼虫被喂食病毒的第4、第5 天观察已液化或即将液化的虫子，将其单头收集在干净的1.5mL 离心管 中，以待进一步纯化。
6. 病毒的纯化： 将 离心管 中的虫尸高速震荡，必要时用牙签搅拌，加1mL 1×PBS，10μL 10%SDS（如果对病毒纯度要求不高，可以用 蒸馏 水代替所有涉及到的溶液）充分混匀；500 rpm离心5min，取上清；将上清液转入另一个 离心管 ，4000rpm 离心10min，取沉淀，用1mL1×PBS 重悬。
7. 重复6～7 步2 次，于所得的沉淀中加1mL1×PBS 重悬，直到病毒较纯。置4℃保存备用。
1. 学习病毒的分离纯化方法
2. 通过病毒的分离纯化进一步理解病毒与宿主的相互关系
二、基本原理
杆状病毒是一类寄生于节肢动物的杆状的病原微生物。其宿主主要是鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫, 还有一些杆状病毒可以感染甲壳纲的节肢生物。杆状病毒常常包埋于由蛋白质组成的包含体基质(polyhedron/granulin)中。根据包含体的形态和病原微生物在(昆虫)细胞中的分布, 可以将杆状病毒划分为核多角体病毒属(NPV)和颗粒体病毒属(GV)两个属。其中核多角体病毒属又根据病毒粒子包膜中的粒子数目不同而划分为多粒包埋型核多角体病毒(MNPV)和单粒包埋型核多角体病毒(SNPV),
杆状病毒在其生活史中具有两种形态, 出芽病毒粒子BV(budded virus)和包埋型病毒粒子ODV(occlusion derived virus)。ODV 被包埋于由多角体蛋白质组成的包含体中, 包含体的外侧还有多角体囊膜。多角体在环境中非常稳定, 能对病毒粒子起到保护作用。当多角体被昆虫幼虫吞食后, 在虫体中肠的偏碱性环境中能迅速溶解释放出病毒粒子, 病毒粒子便由中肠开始感染虫体。ODV 对于杆状病毒在环境中的传播起重要作用。BV 使病毒感染细胞的早期形成的出芽病毒, 它在从细胞膜上出芽时获得了一种病毒编码的囊膜蛋白, 此囊膜蛋白可以与细胞表面的特定受体相结合, 对病毒粒子在虫体内的传播和体外增殖体系的细胞之间的传播中起重要作用。
杆状病毒的BV 和ODV 形态除了以上的不同之外, 病毒粒子及其囊膜的组成基本是相同的。
ODV 只能在宿主个体之间的传播期起作用，BV 在细胞之间的传播起作用。因此不同的病毒形式应
该采用相应的感染方法。
感染后的棉铃虫尸体体内充满病毒，根据病毒和宿主组织碎片的特性差异，则可以采用差速离
心的方法进行病毒的分离纯化。
二、实验材料：棉铃虫 及棉铃虫核型多角体病毒 棉铃虫饲养人工饲料（配方为：黄豆粉80g, 小麦粉80g, 酵母粉16g, 琼脂14g, 维生素C 20 片, 维生素B 15 片, 山梨酸1g, 苯甲酸钠1g, 冰乙酸5ml, 尼泊尔金乙酯2g, Benlate 0,05~0.1g, 加水至1L。）镊子、 二十四孔 细胞培养 板、橡皮筋、培养皿、卫生纸、纱布、1.5mL 离心管血球计数板
三、实验 仪器 ：
普通光学显微镜 生物 化学培养箱
四、实验内容急操作步骤：
1. 病毒的稀释：将病毒原液按照10X 稀释法稀释到合适的浓度。
2. 显微计数：取一块干净的载玻片（在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物应进行，清洗后才能使用）将100μl 病毒稀释液滴于血球记数版的计数室内进行镜检。
3. 口服感染和注射感染：A 口服感染：将饲养棉铃虫幼虫的24 孔板在紫外灯下灭菌2h, 每个孔中放入一块饲料, 饲料的大小以能让4 龄幼虫一夜吃完为宜；在其上滴加1×106 个棉铃虫病毒多角体；在每个孔中加入1 头3 龄未—4 龄初的棉铃虫幼虫, 盖上盖子, 盖子与底板之间加上卫生纸防止幼虫逃逸, 放入28℃温箱培养, 当食物吃完后应补加饲料培养基；大约4d 后, 棉铃虫幼虫开始液化, 收集棉铃虫的虫尸做进一步的纯化。B 注射感染：取3 龄末棉铃虫幼虫放于冰上；戴上手套, 用50μl 微量注射器；将10μl 含BV 的溶液注射于幼虫腹部, 两侧腹趾之间的皮下。
4. 病毒感染后，棉铃虫宿主病理过程的外部症状观察：：病毒感染昆虫后，表现出病毒感染的特有的外部症状，这些外部症状和虫龄、感染剂量、营养、温度、病毒与宿主的亲和性、幼虫的体质等许多因素有关。得病后的宿主幼虫动作迟钝，食欲减退或停止取食，虫体肿胀，表皮具光泽，幼虫死后表皮变得十分脆弱，轻触即破，流出脓状液体。。
5. 病毒的收集：在幼虫被喂食病毒的第4、第5 天观察已液化或即将液化的虫子，将其单头收集在干净的1.5mL 离心管 中，以待进一步纯化。
6. 病毒的纯化： 将 离心管 中的虫尸高速震荡，必要时用牙签搅拌，加1mL 1×PBS，10μL 10%SDS（如果对病毒纯度要求不高，可以用 蒸馏 水代替所有涉及到的溶液）充分混匀；500 rpm离心5min，取上清；将上清液转入另一个 离心管 ，4000rpm 离心10min，取沉淀，用1mL1×PBS 重悬。
7. 重复6～7 步2 次，于所得的沉淀中加1mL1×PBS 重悬，直到病毒较纯。置4℃保存备用。
