那怎么样冻存细胞才能保证细胞能正常复苏，不至于冻存死亡呢？

在冻存过程中减少冰晶的产生，这样细胞就不会刺破，根据这个目的进行冻存方法的改进。有些细胞是95血清5培养基，还有现成的冻存液都是可以用

冻存前一定要保证细胞状态良好，细胞处于对数生长期，否则不管后面怎么处理，冻存后的细胞状态必然有影响。若细胞密度偏高，培养基已经略微变黄，细胞状态正常，需要换液培养2h以上再冻存细胞；若已完全变黄，细胞死亡超过20%，需要传代后再重新培养至状态正常后再冻存细胞。可以选择用程序性冻存盒直接放到-80度冻存细胞，但要记得异丙醇要及时更换，一般用4-5次异丙醇含水量就超标了，不再适合冻存细胞使用。

冻存细胞都会有一部分细胞死亡，所以冻存剩下的活细胞数量才是决定细胞复苏后能否正常养起来的关键。一般冻存不容易死的细胞数量每管在100-200万就够了，一些冻存很容易死的细胞，比如NK92、THP-1、SF9等细胞数量要稍微高点，300-400万左右为宜。冻存液一般1ml左右每管，这个基本每个实验室都差不多。可以将冻存管依次在4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。-80度不适合细胞长期保存，只能短期保存，最好不要超过一周，否则有部分细胞系活性可能会下降很厉害，长期保存的细胞最好放液氮罐保存。

10%DMSO+纯90%血清梯度降温，或者直接用商品化的无血清冻存液效果比DMSO冻存液好很多