细胞的冻存和复苏

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一、原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO ）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
二、操作步骤
（一）冻存
1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱 （－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）复苏
1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。
6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
三、试剂和器材
器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机 等
试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）
附：冻存液配制：
培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。