细胞的冻存与复苏

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为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70℃~-196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

一、细胞的冻存: 为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。

有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：

◆包含10%甘油的完全培养基，

◆包含10%二甲基亚砜(DMSO )的完全培养基，

◆50% 细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基，或

◆50% 细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜 的新鲜培养基。

对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：

◆50% 细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或

◆包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养 级BSA的新鲜无血清培养基。

1.悬浮细胞

●计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

●以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。

●分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。

●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

2.贴壁细胞

●使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。

●在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。

●以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

●以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。

●分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。

●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

二、冻存细胞的复苏 :冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂(DMSO或甘油)敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。

1.直接铺板方法

●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。

●直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。

●培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。

2.离心方法

●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。

●把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。

●以大约80x g离心2到3分钟。

●弃去上清。

●在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。

●细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。

三、细胞的分化、衰老与死亡

1.细胞的分化:一个成年人全身细胞总数约1012个，可以区分为200多种不同类型的细胞：形态结构，代谢，行为，功能等各不相同。追根溯源，这么多种细胞均来自一个受精卵细胞。所以，通常把发育过程中，细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。细胞分化发生在胚胎阶段，也发生在胎儿出生以后，乃至成人阶段。例如，人体血细胞的产生和分化，这个过程在人的一生中一直持续着。

由旺盛生长不断分裂的细胞，转入分化，通常从细胞周期中G1期开始时一个确定的点G0点“逃逸”出细胞周期。旺盛生长分裂的细胞和各种分化了的细胞，它们的基因表达和代谢活动各不相同。

2.细胞的衰老:体外细胞培养实验证明：

成纤维细胞：来自胎儿传代50次后衰老死亡,来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关);来自小鼠传代14--28次后衰老死亡,来自乌龟传代90--125次后衰老死亡。

细胞衰老过程中会发生一系列的变化，包括：蛋白质合成速度降低，已有蛋白质结构变化，特异蛋白质成份出现;同时，细胞核，线粒体，膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变。

细胞衰老原因，尚无定论，出现过好几种理论与假说，其中得到较广泛认可的是“自由基损伤假说”。

3.细胞凋亡:细胞的死亡是个体存活的正常现象，常见的细胞死亡形式有3种：坏死、凋亡和细胞毒性。多细胞生物的生命活动中，因为环境因素的突然变化或病原物的入侵，导致一部分细胞死去，称为细胞的病理死亡，或细胞坏死。坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡;细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于其它两种细胞死亡机理，如杀伤T细胞的细胞毒性作用。

还有一种情况，一部分细胞的死亡是生物个体正常生命活动(代谢、生长、发育、分化)的一个必要部分;似乎带有“牺牲局部，保全整体”的意味。这种情况下的细胞死亡，明显地受遗传控制，称为细胞凋亡。 凋亡(Apoptosis)则是程序性的、正常的细胞死亡，是机体清除无用的或者不想要的细胞的手段。它与细胞坏死是两个截然不同的过程，无论从形态学、生物学还是生化的特征来说，都有明显的区别。细胞凋亡现象普遍存在于生物界。细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色。作为细胞的一种基本生命现象，凋亡失控的结果将是可怕的：凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病;而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征(HIV)、重症肝炎与退行性神经疾病，如老年性痴呆症(Alzheimer"s disease)、帕金森氏症(Parkinson"s disease)。因此研究细胞凋亡及其机理具有重要的理论和实践意义。

四、细胞凋亡与坏死的区别

坏死

形态学特征-膜完整性丧失,胞浆和线粒体膨胀 ,全细胞裂解

生化特征-离子内环境失调,非能量依赖性的(被动过程，在4°C也可以发生),随机消化DNA(电泳显示为DNA弥散状态),Postlytic DNA断裂

生理学特征-影响群组细胞 由非生理学因素引起(如补体攻击、代谢中毒、缺氧等),被巨噬细胞吞噬, 周围有明显的炎症反应

凋亡

形态学特征-胞膜出芽，但保持完整,染色体聚集在核膜周边,胞浆收缩、细胞核凝集,最后细胞分裂为凋亡小体,Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加

生化特征--ATP依赖性的(主动过程，在4°C不能发生),以核小体为单位剪切DNA(电泳显示为DNA ladder),Prelytic DNA 断裂,线粒体释放多种因子至胞浆中(细胞色素c、AIF),Caspases级联活化,膜对称性改变(PS外翻)

生理学特征--只影响单个细胞 ,由生理学刺激诱导(如生长因子缺乏、激素环境改变等),被临近细胞和巨噬细胞吞噬 无炎症反应