简介
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
原理
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
当细胞冷到零度以下，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶;相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤，同时防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶，并防止DMSO在液体状态下对细胞的毒害作用，快速使细胞进入复苏和生长状态。
用途
更新种子库中的细胞及实验需要
材料与仪器
【材料与试剂】待复苏的细胞、100 X 双抗、胎牛血清、相应细胞的培养基、75% 乙醇；
【实验仪器】37度恒温水浴锅、细胞培养皿（6 cm）、倒置相差显微镜、离心机、细胞房专用超净台、移液枪及移液枪头（无菌或灭菌后烘干）、培养箱、移液管。
步骤
一、试剂准备（以 293T 细胞为例）
1、DMEM 完全培养基（10% 胎牛血清）：44.5mL DMEM+5 mL胎牛血清+500 μL 100 X 双抗，摇匀，4℃ 冷藏保存，使用前30 min放于细胞房中室温预热。
2、提前将水浴锅打开，设置 37℃。
二、细胞复苏
1、 超净工作台使用前紫外线照射30 min，打开通风，用75% 酒精擦拭台面，保持台面干净整洁。
2、将冻存细胞从-80℃ 冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2 min 内，如从液氮中取出，粗需要待冻存管中漏进去的液氮挥发）37 ℃ 恒温水浴中预热水浴锅中（或在手心中反复摩擦），不停晃动以化冻，并尽量保持冻存管的管口不浸入水中。
3、 在室温下以1000 rpm的转速将细胞悬液离心 5 min并弃上清（离心的速度和时间根据细胞系的不同有所差异）。
4、用1 mL DMEM完全培养基重悬细胞，并转移进6 cm皿（每皿中加入3-4 mL细胞悬液）中，摇晃均匀，放入37℃ 恒温细胞培养箱中（5% CO2）。
5、过夜后（～12h），观察复苏细胞的状态，并及时（每48 h）更换DMEM完全培养基一次，并依据情况，决定是否需要重新冻存细胞保种。
6、悬浮细胞操作同上，培养基使用悬浮细胞培养基，培养皿为细胞培养瓶，37℃ 细胞摇床（5% CO2）、110 rpm 。
注意事项
1、冻存记录：保存冻存细胞的精确记录是很重要的。需建立细胞生长史、名称、传代次数、冻存日期、复苏次数、生长培养液和在冻存器中的位置都是应记录的项目。
2、冻存液：应用补充 10%~20% 胎牛血清的完全培养基和 10% 甘油或 DMSO。最佳冻存液配方在比较 FBS 浓度（10%~20%)，DMSO（5%~20%）或甘油（10%~15%）浓度后决定。
在低温状态保存数天后进行复苏效率的比较。
3、DMSO具有细胞毒性，复苏细胞的过程操作要迅速，并用 3 倍体积以上的完全培养基进行稀释。
4、冻存细胞应选择传代次数较少的细胞，当细胞传代高于15-20 代后，细胞应丢弃，复苏新的细胞再进行试验。
5、复苏后的细胞不能立即进行试验，等待细胞稳定后，传代 2-3 代后，方可进行相关实验。
6、复苏过程中需要特别注意冻存管中是否漏入液氮，如漏有液氮需等液氮挥发后再放入水浴锅中，在水浴锅中化冻时，尽量避免管口沾水，导致复苏的细胞有发生污染的可能。
常见问题
1、 复苏细胞的状态与冻存前以及复苏过程都有关系，应选择状态较好的细胞进行冻存。
2、 -80℃ 冻存的细胞一般应在 3-6 个月内进行复苏或处理。若想长久保存，应转移进液氮中，可以保存1年以上。
3、.复苏后细胞状态不佳，可考虑重新复苏，若重新复苏后细胞状态仍旧不佳，可考虑适当提高胎牛血清的用量（从10%提升至15%，最大提升至20%），待细胞状态恢复后再使用平时使用的培养基。
来源：丁香实验
