4 个回答
dxy_y6ygzew3
请问博主 优化后的具体步骤油吗？能取到多少细胞呢？
bamboopiggy
1.将肝脏摘下，置入预热37°C含0.5 g/L 胶原酶IV的孵育液50 mL中，剔除肝包膜和结缔组织，使细胞散落.孵育时间20 min，其间水浴振荡200 r/min.孵育液用200目的不锈钢筛网滤过，得到肝组织细胞悬液.
2.将上述肝组织细胞悬液以500 r/min离心10 min，获得细胞团块.加入PBS液50 mL，充分吹打悬浮后，再以50 r/min离心2 min，保留上清液.此时的沉淀为肝实质细胞团块，而上清液即为非实质肝细胞悬液(NPC).
3.将得到的NPC以500 r/min离心5 min，获得沉淀，再经PBS液洗涤2次，最终悬浮于DMEM液40 mL中.
4.取10 mL的离心管若干支，仔细将Percoll分离液铺层:底层为70%的Percoll 2 mL，密度是1096.8 g/L;中层为30% 的Percoll 2 mL，密度是1044.8 g/L;顶层为NPC细胞悬液2 mL.铺层时尽量减少振荡，保持每层之间界面清晰.放入高速冷冻离心机，离心(4°C，800 r/min，20 min).
5.取出离心管后，可见30%和70% 界面之间有一白膜状的细胞层面，此层即为富含Kupffer细胞的NPC细胞，用尖吸管轻轻将此层细胞吸入，移入另一试管中,加入PBS液，以500 r/min离心5 min，反复2次.最终细胞悬浮于4 mL DMEM液中.
6.取部分用于计数和鉴定.用苔盼蓝染色检测细胞活性，并计数细胞量.将获得的细胞以1×108/L的密度接种于3.5 mm的培养皿中，每个培养皿预先放置含小牛血清的DMEM液1.5 mL.置入37°C，50 mL/L CO2，950 mL/L O2，950 mL/L 湿度的CO2的培养箱内.
7.培养60 min后取出，洗去非贴壁细胞，获得纯化的Kupffer细胞.
Eason老歌迷
具体步骤你可以去查文献，或者什么的。我可以给你说个大概。1小鼠肝脏 Kupffer细胞分离和纯化；2消化一小时，摇匀一次，移液枪轻轻吹打，待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，滤去未消化的组织块和结缔组织。
用15ml离心管收集细胞悬液，离心两次，取上清，可以去除大部分的小盘肝脏细胞。然后，1500转，5min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基悬浮细胞沉淀。然后不连续密度梯度离心，2000gx20min 4℃。离心后取第三层，收集后 PBS 漂洗两次以去除Percoll液。将盛有漂洗过的细胞沉淀的离心管插入到冰中40min。调整细胞浓度为1x106个/ml，接种到24孔板(每孔1ml培养液)。10%RPMI1640混悬细胞后铺板贴壁，30min 37C。PBS 洗两次去除非贴壁细胞后，所得细胞即为小鼠肝脏Kupffer细胞。
未来9
可以参照一下这篇文章：
https://wenku.baidu.com/view/94c25dbbbb4cf7ec4bfed074.html
