求助胆结石的中性粒细胞胞外网络nets怎么做啊

1.NET测定缓冲液 将500 ml RPMI 1640基础细胞培养基（未提供）与5 g牛血清白蛋白测定试剂和500 ul氯化钙（1M）测定试剂混合制备NET测定缓冲溶液。NET测定缓冲液不是用来杀菌的，也不需要在组织培养罩中制备或使用。在细胞刺激和添加核酸酶之前，将NET测定缓冲溶液预热至37℃，以确保快速激活和随后的核酸酶活性。储存未使用的NET分析缓冲液、无菌过滤器、等分试样，并储存在-20℃。注意：血清中含有能消化NETS的DNASE，应避免使用。

2.PMA（1 mm）检测试剂-使用前，将1 ul PMA（1MM）检测试剂添加到5 ml预热的NET检测缓冲液中，制成10X工作储备溶液注：PMA是一种潜在致癌物。处理此解决方案时，请穿戴适当的防护措施并谨慎使用。

3.A23187（25 MM）含量测定试剂-使用前，将10 ul A23187【25 MM】含量测定试剂加入1 ml预热的净含量测定缓冲液中，制成10X工作储备溶液。

4.S7核酸酶测定试剂对于一个24孔板，在使用前立即在12 ml预热的NET测定缓冲液中稀释12 ul S7核酸酶检测试剂（供应量为15000 U/ml），制成15 U/ml工作溶液

5.NET含量测定中性粒细胞弹性蛋白酶底物小瓶中含有15 MM N-甲氧基琥珀酰-ala-la-pro-val对硝基苯胺，这是中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。为了测定24个样品，一式两份，并使用标准曲线，将225 UI NET测定中性粒细胞弹性蛋白酶底物稀释到6.5 ml PBS中（1:30稀释）

1.

使用脱氧核糖核酸酶I溶液对待测细胞进行预处理,消除非NETs来源的DNA;

2.

使用PMA溶液对待测中性粒细胞进行刺激,刺激中性粒细胞活化,诱导NETs生成;

3.

使用抗DNA/组蛋白H1抗体及免疫荧光二抗对活化后的中性粒细胞进行染色,并使用DAPI进行细胞核染色定位,通过免疫荧光法检测细胞表面DNA/组蛋白H1的含量,对NETs的生成进行定性分析;

以下是一种常用的染色方法和相关步骤的简要概述：

1. 准备样本：收集包含中性粒细胞和胆结石的样本，如胆汁样本或胆固醇结石切片。

2. 固定样本：将样本固定在载玻片上。常用的固定剂包括4% paraformaldehyde（PFA）或冰乙酸。

3. 渗透化处理：使用0.1% Triton X-100或其他适当的渗透剂处理样本，以使细胞膜通透，方便抗体和染料进入细胞。

4. 抗体染色：使用适当的抗体来标记中性粒细胞的核和胞外网络结构。一种常用的标记方式是使用抗组蛋白H3抗体标记细胞核，同时使用抗嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase）或抗MPO（髓过氧化物酶）抗体标记胞外网络结构。

5. 组织染色（可选）：如果使用胆固醇结石切片，可以进行其他染色以显示胆固醇结石的成分和组织结构。

6. 观察和分析：使用荧光显微镜观察染色后的样本。根据研究需要，使用图像分析软件对中性粒细胞和胞外网络进行定量和定性分析。