重叠延伸pcr连接不上

重新检查引物，尤其注意引物的方向，并且保证引物之间的温度差别不要太大，

有可能是引物的问题，检查引物后尝试

我也做过重叠延伸PCR，没出现过你这么多的问题。

pfu外切酶活性太高，缺dNTP的时候特别容易降解引物和融合的片段，所以容易在重叠的部位产生错误，要多加点dNTP，最后加pfu

第二轮重叠延伸的时候两个片段要加的少一点，延伸的时候容易错配，退火温度不能太低，延伸几个循环后再加两端引物。

发生在基因后端的23处突变，实在无法解释，不知道你片段多长，会不会在测序的后端是测序的问题，换个测序好的公司或从后端测试试。