重叠延伸pcr连接不上
dxy_dok45ep8
需要重叠延伸连接四个基因片段，分别是1072bp，2760bp，3423bp和1008bp，已经两两重叠p好了，经胶回收纯化后作为模板。这两个重叠好的片段之间的重叠区域为30bp，但是无法融合上。求大佬指点一下
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3 个回答
bamboopiggy
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重新检查引物，尤其注意引物的方向，并且保证引物之间的温度差别不要太大，
土井挞克树
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有可能是引物的问题，检查引物后尝试
此用户已注销
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我也做过重叠延伸PCR，没出现过你这么多的问题。
pfu外切酶活性太高，缺dNTP的时候特别容易降解引物和融合的片段，所以容易在重叠的部位产生错误，要多加点dNTP，最后加pfu
第二轮重叠延伸的时候两个片段要加的少一点，延伸的时候容易错配，退火温度不能太低，延伸几个循环后再加两端引物。
发生在基因后端的23处突变，实在无法解释，不知道你片段多长，会不会在测序的后端是测序的问题，换个测序好的公司或从后端测试试。
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