293T 细胞包装和扩增反转录病毒

基本方案 1 磷酸钥/DNA 沉淀瞬时转染 Phoenix 反转录包裝细胞

$材料（带V 项目见附录 1) 75c m 2组织培养瓶中处于指数生长期的包装细胞（亲嗜性或双嗜型；见辅助方案2) x/P B S 不含 C a2+ 或 M g 2+ 0 •0 5 % (m / T O 胰酶/0•53m m o l / L E D T A 完全培养基： D M E M ， 1 0 % (V A O 热灭活的 F B S ， l O O U /m l 青霉素， l O O U / m l 链霉素， 2m m o l / L L -谷氨酰胺 50m m o l / L 氯喹（P B S 配制，一20°C 保存） V 2m o l / L CaCl2 1〜2 m g /m l 反转录载体质粒经C s C l 密度离心或者Q i a g e n 试剂纯化（图 14. I.1 和图 14. 1.2) N/ 2 X H eB S ( H E P E S 缓冲盐）， p H 6.99 6c m 组织培养皿 15m l 无菌离心管（加盖，可旋紧） JVotI(821) Ncol(6665) K I I1 ______ I pRSV V iI m p〇i 卜朧 v _ 卜 2 Poiy(A) pRSVgpIRES-Lyt2 M?rt(818) Notl(2795) I PCMV ~ f e ). pCMundefinedEa iVcoI(818) Nco\2n5) Lpg- M Y -^)~ (，l J ----1 ¾ ¾ pCMundefinedEeco 图 14. I. I Phoenix反转录包装所需的质粒。 293T细胞稳定转染 PRSVgpIRES-Lyt2载体。通过流式细胞仪分选出 Lyt-2表面蛋白高表达的克隆，命名为 Phoenix-gp (中NX-GP)。 Phoenix-gp克隆然后稳定转染其中一个包膜蛋白。通过稳定表达的包膜蛋白筛选。利用 pCMV# Ea和 pCMV# Eeco 质粒分别构建 Phoenix亲噬性（中N X -A )和 Phoenix双嗜型（$N X -E )包装细胞$

图 14. I.2 从 Phoenix包装细胞扩増病毒所需的一些标准质粒。不同的连接位点允许靶基因的克隆，以及 D N A 文库或者是肽文库的构建。其中一些质粒的稳定表达克隆通过G418筛选或者通过流式细胞仪分选。 EGFP，增强绿色荧光蛋白； EMCV，脑心肌炎病毒； IRES，内部核糖体插人位点。 L 每瓶 75c m 2培养瓶的 P h o e n i x细胞用 IOml P B S 轻轻洗一遍。弃去废液，加入 2ml 0.05% (m /V ) 胰酶/0.53m m o l /L E D T A ，置室温 5m i n 。快速拍打瓶底直到形成单细胞悬液。加入 15m l 完全培养基终止胰酶反应。 2•细胞计数（附录 3A ) ，每个 6c m 培养皿中加人 3m l 完全培养基，含 2 X 106个细胞，培养 24h ，细胞汇合生长到8 0 % 。 3 . 所有的转染试剂在使用前放至室温。 4 . 每个 6 c m 培养皿加入 4]u l 50m m o l /L 氯喹（加入转染试剂后终浓度为50]Ltmol/L )。轻轻摇动平板，混匀。放人培养箱， 12h 内加入2 X H e B S 。如果不需要得到最高滴度，只是为了比较不同克隆的相对滴度。最好不要使用氯喹。 5. 1 5 m l 离心管中每管加入61/xl2m〇 l / L C a C l 2 ，然后用移液器将5/x g D N A 加在离心管的管壁。再加入 434M 1 水，轻弹管壁使之混匀充分。 6 . 向 C a C W D N A 混合液加入0,5ml 2 X H e B S ，用手动调节移液器充分混合。第一次使用 H e B S ，最好确定沉淀形成最佳吹打时间（2〜20s)。

7 . 用移液器把转染混合物逐滴加入氯喹处理过的6c m 培养皿中。相差显微镜下观察细胞上面是否有沉淀物形成。 8. 37°C 培养 4〜8h 。 9 . 小心地吸去培养皿中的培养基，加入 4m l 的新鲜培养基。培养至次日早上。 10. 再次更换培养基， 32°C 继续培养，这样可以降低细胞分裂次数，提高病毒颗粒的稳定性。 11. 48h 和（或） 72h 后，轻轻吹起细胞，收集反转录病毒上清。最好使用新鲜的上清液感染，因为储存上清液的滴度会降低。转染 24h 后，包装细胞接近全部汇合生长。转染 36h 以上才能得到高滴度的反转录病毒。 72h 内每 12h 收集上清避免滴度损失。因此，必须及时补充新鲜培养基。假如反转录载体带有像G F P 和 (3-半乳糖苷酶之类的标记，感染后 48h 就可以通过荧光显微镜和组织化学染色观察转染效率。整个系统优化后的转染效率达到 5 0 % 以上。用新鲜的病毒上清感染受体细胞收获的反转录病毒滴度最高。如果上清不是在几小时内使用，应当放置冰上。冻融一次，上清病毒的滴度会下降一半。备选方案 1 水疱性口炎病毒 G 蛋白的假型反转录病毒注意：操作 V S V - G 假型病毒体要非常小心。 V S V - G 假型病毒能把病毒体的感染性传递给人细胞。而且 V S V - G 假型病毒被用来表达已知的原癌基因，所以必须认真执行正确的法规监督。附加材料（其他材料见基本方案 1) Phoenix-gp细胞系（见辅助方案2) 水疱性口炎病毒G 蛋白（V S V -G ) 表达质粒：如 p M E -V S V G ，或者 p H C M V - G 1. Phoenix-gp细胞铺板，转染（见基本方案1，步骤 1〜2)。 2 . 磷酸钙沉淀方法共转染5M g PM E - V S V G (或者 p H C M V -G ) 和 5M g 反转录病毒载体，用无菌双蒸水调节总体积为Iml (见基本方案1 ，步骤 4〜10)。 V S V - G 表达载体带有非常强的启动子，例如 Sra (p M E -V S V G ) 或者是 C M V 早期启动子（p H C M V -G )。整合到包膜脂质双层的V S V - G 蛋白数量和细胞芽变产生的 V S V - G 蛋白呈正比。 3 . 收集病毒上清（见基本方案1，步骤 11)。离心，一80°C 保存（见辅助方案1)。感染前用细胞培养基1 : 100稀释。辅助方案 1 水疱性口炎病毒 G 蛋白假型反转录病毒的浓缩和低温储存材料（带V 项目见附录 1) 水疱性口炎病毒G 蛋白假型病毒Phoenix细胞的反转录病毒上清（见备选方案1) V T S E 溶液 0. 45]itm过滤器

B e c k m a n L 系列超速离心机（或同等设备） B e c k m a n S W 4 1 或 S W 2 8 转子和离心管（7 0 % 乙醇清洗，层流净化柜中晾干） 1 . 用 0.45M m 过滤器过滤收集病毒上清，检测回收率。 2 . 转移到^土1仙11离心管中，用3界28或者3冒41转子4°(：， 50 0 0 ( ^ 离心 3 ^ 小心倒去上清，吸干剩余的液体。 3 . 用 1/100〜1/200原体积， 4°C 放置 H 〜24h 的 T S E 溶液重悬沉淀。移液器轻轻混勻，一 80°C 保存 4 个月。辅助方案 2 Phoenix细胞的培养材料（带V 项目见附录 1) Phoenix 亲嗜性、Phoenix 双嗜性和（或） Phoenix-gp 细胞系（http://w w w .stanford,edu/group/nolan/) 完全培养基： DMEM， 1 0 % (V A O 热灭活的FBS， 100U /m l青霉素， lOOU/ml 链霉素， 2mmol/L L ~谷氨酰胺 V 不含Ca2+ 或 Mg2+的 PBS 0 . 0 5 % (m/V ) 胰酶/ 0 . 5 3 m m ol/L ED TA 冻存液，冰上放置： 9 0 % 热灭活的FBS/ 1 0 % ( V A O 二甲基亚砜 ① M SO) 50m g/m l 匀霉素 B(hygromycin B ) ， PBS 配制 2m g / m l 白喉毒素，无菌水配制 75c m 2组织培养瓶 50m l 带盖锥底离心管低速离心机 2m l 冻存管冻存盒 1. 37°C ， 5 % (：0 2的细胞培养箱中，每 75c m 2组织培养瓶含20〜30m l 完全培养基培养 P hoenix亲嗜性、 P hoenix双嗜性和（或） Phoenix-g p 细胞。如果 24h 后裂解细胞，每瓶种植1.0X 107个细胞； 48h 后裂解细胞， 4.5X 106个细胞/瓶； 72h 后裂解细胞， 2 X 106个细胞/瓶； 96h 后裂解细胞， I X l O 6个细胞/瓶。 2 . 当细胞达到 8 0 % 〜 9 0 % 汇合生长，吸去上清， 10ml PBS轻洗。弃去，加入 2ml 0.05%胰酶/0.53m m d /L E D T A ，室温消化5miri。快速拍打培养瓶直到形成单细胞悬液。加入 15m l 完全培养基终止胰酶反应。细胞计数并在培养瓶中种植适当数量的细胞培养（步骤 1)。 3 . 冻存细胞：当细胞达到8 0 % 〜9 0 % 融合，消化细胞（步骤 2)，计数，移至 50m l带盖锥底离心管， 4°C ， 500g 离心 3〜5m in。弃去上清，用预冷的冻存液重悬，细胞终浓度为 4 X 106个细胞/m l。一瓶长满有 I.5 X I O 7〜2. 5 X I O 7个细胞。 4 . 每个冻存管中加入I m l 冻存液，一 80°C 放置直到结冻，然后放入液氮罐保存。 5 . 复苏细胞： 75cm2组织培养瓶加入 20〜30m l完全培养基。从液氮罐中拿出冻存管，

迅速放入37°C 水中，不停摇动。用吸液器将冻存管中的细胞吸入含完全培养基的 75c m 2 培养瓶中，然后按照步骤1 和 2 培养。注意：做好脸部保护，防止冻存管内液氮迅速气化而发生爆炸。 6 . 重新进行药物筛选， 75c m 2培养瓶加入20m l 含有 200m g /m l 匀霉素 B 和 2M g/m l 白喉毒素完全培养基，细胞密度为5 X 105。 3〜4d 更换培养基。至少要筛选 1 周。推荐每隔几个月都要用药物进行筛选以保证包装蛋白的表达量。基本方案 2 感染贴壁细胞材料 N I H 3T 3 细胞成纤维细胞生长培养基（F G M ) : 如完全培养基： D M E M ， 1 0 % (V /V ) 热灭活的 F B S ， l O O U /m l 青霉素， l O O U /m l 链霉素， 2m m o l /L L -谷氨酰胺 Phoenix产生的反转录病毒上清：亲嗜性或者双嗜性（见基本方案1 ) 或者假型病毒 (见备选方案1);新鲜收集或者冻融（见辅助方案2)，或者浓缩（见辅助方案1) 4m g / m l Polybrene (海美溴铵），或者 5m g /m l 硫酸鱼精蛋白（ P B S 配制， 0.2M m 过滤， 4°C 储存） 6c m 组织培养皿 0 •45fx m过滤器 1•在6c m 培养皿加入3m l F G M ，加入 2 X 105处于指数生长期的N I H 3T 3 细胞。 37°C ， 5 % C O 2培养过夜。 2 . 感染前，用〇 .45M m 过滤器过滤新鲜收集的病毒上清。如果需要，室温， 500g 离心 5m i n 除去细胞碎片和活细胞。小心吸取上清到新管中，尽量避免碰到沉淀。在病毒上清中加入4m g / m l Polybrene (海美溴铵），或者是 5m g /m l 硫酸鱼精蛋白增加感染效率。 3 . 吸去 N I H 3T 3 的培养基，加入 I m l 反转录病毒上清。继续培养2〜16h 。如果有需要， 5〜 6h 内每小时用新鲜的病毒上清换液，可提高转染效率，特别是生长缓慢的细胞。根据靶细胞在聚阳离子复合物存在时的活力决定培养时间。 4 . 吸去反转录病毒上清，加人 4m l F G M 。转染 48h 后检测靶基因的表达。备选方案 2 贴壁细胞快速（spin) 感染（见基本方案 2) 附加材料（其他材料见基本方案 2) 带有平板支架的Beckman GS-6K R 或者是 Sorvall RT-3000B 离心机 1 . 在 6 孔板中加入I.5m l 含 I X l O 5处于指数生长期的NIH 3T 3 细胞的 F G M 培养基。 37°C ， 5 % C O 2培养过夜。 2 . 准备反转录病毒上清（见基本方案2 中，步骤 2 和 3)。 3 . 吸去 NIH 3T 3 的培养基，加入 0.5m l 反转录病毒上清。用 Parafilm封口膜封住板口，室温， 1200g 离心 I.5h 。备选：新鲜分裂细胞可以像悬浮细胞一样直接重悬在病毒上清（见备选方案 3 ) 。

离心帮助细胞和病毒的立即接触。 4•撕去Pam film 膜，放入 37°C 培养箱培养12〜20h ， 1.5ml F G M 换液 5 . 转染 48h 后检测靶基因的表达。备选方案 3 悬浮细胞的快速（spin) 感染附加材料（其他材料见基本方案2) 处于对数生长期的Jurkat细胞（A T C C ) 完全培养基： R P M I -1640， 10 % (V A O 热灭活的 F B S ， l O O U /m l 青霉素， 100U /ml链霉素， 2m m o l /L L -谷氨酰胺 Bec k m a n G S -6K R 或者是 Sorvall R T -3000B 离心机 2 4 孔板 32°C 培养箱 1 . 准备反转录病毒上清（见基本方案2 中，步骤 2 和 3)。 2 . 室温， 500g 离心 5m i n 沉淀处于对数生长期Jurkat细胞（5 X IO5个细胞/孔）。 3 . 每5 X 105个细胞加入 I m l 病毒上清，种植到 2 4 孔板中。 Parafilm膜封好板口，室温， 1200g•离心1.5h 。撕去 Parafilm， 32°C 培养箱培养过夜（12〜16h )。不同细胞系的离心时间为 5min〜 1.5h ，每次增加 15m in来确定最佳离心时间。 4 . 次日收集Jurkat细胞，室温， 500g 离心 5m i n 。 4m l R P M I -1640完全培养基重悬后加到 6c m 培养皿， 37°C 继续培养48h 以上。

来源：丁香实验

293T 细 胞 包 装 和 扩 增 反 转 录 病 毒

基 本 方 案 1 磷酸钥/DNA 沉 淀瞬时转染 Phoenix 反转录包裝细胞

293T 细胞包装和扩增反转录病毒

基本方案 1 磷酸钥/DNA 沉淀瞬时转染 Phoenix 反转录包裝细胞