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    免 疫 球 蛋 白 融 合 蛋 白 的 构 建

    相关实验：分子生物学实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

     

    基 本 方 案 1 免疫球蛋白融合蛋白的构建

    材 料

    编码靶基因的 D N A
    图 1 4 . 2 . 1 经过修饰的pCDM8 表达质粒含有编码免疫球蛋白恒定区序列。插入 序列编码CD8 蛋白。（A) 带 IgGl编码序列和CD8 插入序列的CDM8 质粒图谱。 (B) CD8 基因部分序列，相 应 的 氨 基 酸 序 列 （下 面 ），产 生 CD8 嵌合体的引物 (方框）。描 黑的为XAoI和 BamHI酶切位点。 （C) 融合蛋白部分序列：融合区 的 BamHI位 点 编 码 两 个 氨 基 酸 （天冬氨酸和脯氨酸）。 EC, 胞 外 区 ； Fc，铰链 区 ，抗体重链的CH2 和 CH3 区 ； TM，转膜区。 电转感受态E. 细 菌 （如 CPI单 元 10. 18，或者是CPMB单 元 1. 8) 寡核苷酸引物， 3'端与待扩增 D N A 序列完全互补， 5'端带有限制性内切核酸酶 位点 V 苯酚缓冲液 无水乙醇 V T E 缓冲液， pH7. 5
    4mol/L 乙酸铵 表 达 质 粒 （如修饰过的P C D M 8 ; 图 14. 2. 2) V T 4 D N A 连接缓冲液， 2 X T 4 连接酶 V 含选择性抗生素的L B 培养基和平板 1. 100/xl含编码靶蛋白的 D N A 模 板 和 正 确 引 物 的 反 应 体 系 进 行 P C R 扩 增 。取 10^x1 P C R 产物琼脂糖电泳检测。 2 . 吸 取 P C R 产物的水相到新的微量离心管，弃去矿物油，加入等量的苯酚缓冲液。振 荡 ，高速离心使之分层。 3 . 吸取上层水相到新的微量离心管。加入等体积的4mol/L 乙 酸 铵 和 2. 5〜3 倍体积无 水己醇。一20°C 放 置 5〜30m i n 。离 心 10〜30m i n ，沉 淀 D N A 。弃去上清。离心机 瞬时离心，尽量吸干残留液体。真空风干，加 入 20^1 p H 7. 5 T E 重悬。 4 . 用相应的内切酶分别酶切4M 1 P C R 产 物 和 0.5ptg质粒。反 应 体 系 为 10〜20M 1。酶切 产物在低溶性凝胶上进行电泳。刀片切下载体和目的片段位置的凝胶， 7〇 °C 溶解 2〜IOniin0 5 . 在冰上配制连接缓冲液： 25M1 2 X T 4 D N A 连接酶缓冲液 2. 5U T 4 连接酶 17. SiLtl H 2O 在微量离 心 管 加 入 7/xl胶 溶 解 后 的 P C R 产 物 和 3M 1 胶 溶 解后的质粒；再加入 40p l 的连接酶缓冲液。 15°C 水浴过夜或者室温2h 至过夜。 6 . 如果有必要， 70°C溶解凝胶。 2.5〜3/x l连接产物电穿孔转化IOOiUl感受态细菌。转 化的细胞在含相应抗生素的L B 平 板 中 37°C 培养过夜。 7 . 在平板上挑取单个克隆，接种含有相应抗生素的L B 培养基中培养过夜，碱裂解法小 量纯化载体D N A ， 20F1 p H 7. 5 的 T E 缓冲液溶解D N A 。 8 . 酶切反应筛选阳性克隆。最好通过测序反应确定P C R 扩增过程中有无发生突变。 基 本 方 案 2 免疫球蛋白融合基因分析 图 14. 2. 2 为分析免疫球蛋白融合蛋白的工作流程图。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) C O S 细 胞 （如 C O S -7细胞）或其他表达质粒的宿主细胞 V D M E M -I O 完全培养基 D M E M -10， 1 0 % N u S e r u m (D M E M -10 完全 N S ) 经纯化含有靶基因的表达质粒，重 悬 在 20M 1 T E 中， P H 7.5 (见基本方案1)。 V P B S D E A E -右旋糖酐/氯喹溶液： P B S 含 l O m g / m l D E A E -右旋糖酐+ 2. 5m m o l /L 氯喹 1 0 % (V /Y ) D M S O , P B S 配制 0.2% C m A O 胰酶/〇 .5m m o i / L E D T A P B S 配制
    图 1 4 . 2 . 2 免疫球蛋白融合蛋白的表达、免疫反应、融合和分泌工作流程图。 2 % (V /V ) 甲 醛 ， P B S 配制 2 % ( V A O 甲 醛 /0.1% (V7 V ) N P -40，P B S 配制 针 对 I g 恒 定 区 的 F I T C 偶 联 抗 体 （单 元 4.1)，浓 度 按 照 厂 家 推 荐 ， D M E M -10 配制 1〜2Mg/ml—抗 （单 元 1 . 3 ) 或 者 1 : 1 0 0 稀释靶蛋白特异的腹水， D M E M - 1 0 配制 针对一抗的F I T C 偶联二抗， D M E M - 1 0 配 制 （单 元 4.1)， 浓度按照厂家推荐 不含半胱氨酸和甲硫氨酸的I M D M 或 者 D M E M 35S 标 记 的 半胱氨酸和（或）甲硫氨酸，即可单独配制也可混合配制。 5 0 % (V /V ) 蛋白 A 珠 子 ， P B S 配 制 ，含 0 . 1 % ( m /V ) B S A 和 0 . 0 1 % (m / Y ) N a N 3 0 . 1 % (W V ) N P - 4 0 ， PBS 配制 V l X S D S 样品缓冲液 14C 标记的蛋白标准品 I O O m m 和 60m m 的组织培养平板 25cm 2组织培养瓶 立式圆筒形混合机，旋转振荡器 免疫突光显微镜 注意：在标记过程中挥发性的35S 混合物会释放出来。 I. C O S 细 胞 在 I O O m m 培养皿中生长达到2 0 % 汇合度，每 个 I O O m m 平板中加入8m l 含 细 胞 的 D M E M -10完全培养基。不含细胞的培养基在下面的步骤里作为阴性对照。
    培养过夜。 2 . 吸去培养基，加 入 5m l D M E M _10N S 完全培养基。除了阴性对照，每个平皿加入1〜 纯化的融合靶基因的质粒，混勻。再 加 入 0.2ml D E A E -右旋糖酐/氯喹 。混勻 ， 培 养 3〜4h 。 3•吸去培养基，加 入 5ml 1 0 % D M S O 的 P B S 溶液。室温放置2m i n ，弃 去 ，加 入 IOml 的 D M E M -10完全培养基，培养过夜。 4•吸去培养基，加入101111?： 6 3 洗 一 次 。加入1.511110.2%胰酶/0.5111111〇 1/乙迟〇丁八， 37°C 放 置 5〜15miri。加样器轻轻吹起细胞。 5 . 分别在两个60m m (含 3m l D M E M - 1 0 ) 培养皿和1 个 25cm 2培 养 瓶 （含 4m l D M E M - 1 0 ) 加 入 500W 步 骤 4 收集的细胞，培养过夜。 6 . 吸 取 60m m 培养皿中上清，如果靶蛋白有特定的功能作为检测指标，可以检测上清 确定有无融合蛋白的表达。 假 如 结 果 为 阴 性 ，用 更 多 的 D N A 转 染 细 胞 ，培 养 几 天 收 集 上 清 检 测 。 7. P B S 洗两次，加 入 2m l 2 % 甲醛，室 温 孵 育 30m i n ，吸去。再 加 入 2m l 2 % 甲 醛 / 0.1% ( V A O N P -40,室温孵育 30m i n 。P B S 洗两次。 甲 醇 或 者 甲 醇 / 丙 酮 溶 液 也 可 作 为 穿 孔 剂 ，而 且 能 够 保 证 在 下 面 步 骤 中 能 被 抗 体 识 别 的 抗 原 表 位 不 被 破 坏 。 8 . 其 中 一 个 平 皿 中 加 入 1.5m l 含 有 针 对 融 合 蛋 白 I g 恒 定 区 的 F I T C -标记抗体的 D M E M -10完全培养基。另外一个加入I.5m l 针对靶蛋白的一抗或者腹水的D M E M - 1 0 完全培养基稀释液。冰 浴 30min， 2ml P B S 洗两次。 9•一抗孵育的平皿里再加入1.5ml F T T C 标记的二抗。冰 浴 30m i n ，然 后 2ml P B S 洗两 次 。荧光显微镜下观察两块平皿的结果。 虽 然 流 式 也 能 分 析 标 记 的 C O S 细 胞 ，但 由 于 其 较 大 的 体 积 使 流 式 分 析 有 一 定 难 度 。每 个 平 m 大 概 有 1 0 % 〜5 0 % 的 细 胞 被 标 记 。假 如 针 对 把 蛋 白 的 抗 体 不 能 标 记 细 胞 而 抗 免 疫 球 蛋 白 重 链 抗 体 标 记 上 细 胞 ，可 能 因 为 C O S 细 胞 表 达 的 靶 蛋 白 不 能 跟 抗 体 结 合 。如 果 抗 免 疫 球 蛋 白 重 链 抗 体 也 不 能 标 上 ，说 明 质 粒 构 建 存 在 问 题 。 1 0 . 步 骤 5 中培养瓶的细胞用4ml P B S 洗一次。加 入 2m l 不含半胱氨酸和甲硫氨酸的 I M D M 或 者 D M E M ， 孵 育 30min。 加 入 [35S ] 标 记 的 半 胱 氨 酸 和 [35S ] 甲硫氨 酸 ，终浓度为 150/xCi/m l 。 旋紧瓶盖防止污染培养箱。培养过夜。 11•收集转染细胞的上清， 900g 离 心 5m i n 去掉细胞碎片，上清移入新管中。 1 2 . 在 500M 1标记上清中加入100/xl蛋 白 A 微珠，在立式圆筒形混合机上4 °C混 匀 lh。 13•瞬时离心，弃去上清， 0.1% N P -40洗 4 次 。 14. 加 入 IOOiUl I X S D S 样品缓冲液，煮 沸 2m i n 。取 20jul电泳，放射自显影。 15, 假 如 I g 融合蛋白能跟抗体发生反应，并能分泌和具有一定的功能，可以大量的制 备重组质粒，瞬时转染C O S 细胞或者获得C O S 稳定转染株。

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    来源：丁香实验

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