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    单 链 抗 体 的 噬 菌 体 展 示 技 术

    相关实验：分子生物学实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

     

    基 本 方 案 1 全套单链抗体噬菌体载体的构建

    材 料

    新鲜分离的小鼠脾脏或者 IO7 杂 交 瘤 细 胞（单 元 undefined3)

    R N A 提取试剂

    R T -P C R 试剂

    D E P C 水

    寡 核 苷 酸 引 物（表 14. 3.1)

    DNA marker

    琼脂糖胶回收试剂盒（Qiaquick Gel Extraction kit， Qiagen)

    10m m o l / L Tris • C U p H 8. 5

    Vent D N A 聚合酶

    d N T P (由 R T -P C R 试剂盒提供）

    P C R 缓 冲 液（由 R T -P C R 试剂盒提供）

    噬 菌 粒 载 体（如 P C A N T A B 5E )
    限制酶 S / il、 及相应缓冲液

    B S A

    T 4 D N A 连接酶和 10X 连接缓冲液

    电转感受态菌£：coli T G - I
    S O C 培养基

    Y T A G 琼脂平板： Y T 培养基， 2 X (附 录 1 ) 含 0 . 4 % 葡萄糖， 100/xg/m l 氨苄青霉素

    Y T A G 培养基： Y T 培养基， 2 X ，含 和 不 含 15% (V A O 甘 油 ， 100/xg/m l 氨苄青霉素

    P C R 仪

    I.5m l 微量离心管

    电穿孔仪器

    0.2c m 容器

    13c m 无菌离心管

    接种环

    1 . 用 R N A 提取试剂盒提取脾脏或者细胞的总 R N A 。溶 解 在 0.5 ml D E P C 水中 ，作为R T -P C R 模 板 。剩 佘 的 R N A 分 装 成 50M 1/管 ，一 70℃ 保存。

    2 . 根 据 R T - P C R 试 剂 盒 说 明 配 制 4 管 48/xl 反 转 录 反 应 体 系 ，每 管 包 含 20/xg 的总R N A ， 0. 5 ug oligo d T 。 95°C 孵 育 I O m i n 后放于冰上终止反应。

    3 . PCR扩增：每 管 加 入 下 列 引 物 混 合 物（表 14.3.1)，引物的终浓度为 50pmol/50ul反应体系，总体积为 2m l 。

    管 1 : 引物Mu-VH1-6-BACK(引物 NO.1〜6，根据表 14.3.1 的比例混合）和引物M u -J H l - F O R (S ) (引物 N o .10)。
    管 2 : 引 物 M u -V H l -6- B A C K (引物 N o .1〜6 , 根 据 表 14. 3 . 1 的比例混合）和引物 M u -J H 2- F O R (S ) (引物 N o .11)。 管 3 : 引 物 M u -V / d -7- B A C K (S ) ( 引 物 N o .16〜22，根 据 表 14. 3. 1 的比例混合） 和引物 M u -Jk I - F O R (引物 N o .32)。 管 4 : 引 物 M u -V k I-7- B A C K (S ) ( 引物 N o .16〜22，根 据 表 14. 3. 1 的比例混合) 和引物]\/[11-]^2卞01^(引物？^〇 ,33)。 1^-?〇尺试剂盒的一个反应体系包括1\?〇尺缓冲液， 0.2111111〇 1/乙〇 11^13， 1〜 2U 耐 热 D N A 聚合酶。 4 . 扩增参数如下: 1 循环 Smin 95〇C 预变性 3 5 循环 30s 95〇C 变性 Imin 55V 复性 Imin 72°C 延伸 1 循环 5min 72〇C 产物延伸 样 品 4°C 保存。 5 . 取 反 应 产 物 ， 1 . 5 % 胶电泳。准备胶回收和重新扩增。如果没有得到满意结果， 参 考 表 14.3.2。 反 应 1 和 2 产物为350b p ，而反应3 和 4 为 330b p 。 注 ：表 14. 3. 1 列出的 M u -V H 7- B A C K (引物 N o .7)， M u -V H 8- B A C K (引物 N o .8)， M u -J H 3-F 〇 R (S ) ( 引物 N o .12)， M u -J H 3-F 0 R (L ) ( 引物 N o .1 5 ) 为 V h 的兼并引物。 M u -V k8- B A C K (S ) (引物 N o .23)， M u -V k： 8- B A C K (L ) (引物 N o .31)， M u -J K 3-F 0 R (S ) (N o . 3 3 ) 为 V k 的兼并引物。文库构建不需要这些引 物 ，但当上述引物混合物扩增失败，可以考虑这些引物。这些引物导致抗体区末端 发生突变，而这些突变会影响s c F v 的亲和力，所以不推荐。上述步骤中提到的引物 不能通过R T -P C R 扩增出某些特殊杂交瘤时，建议先确定重链和轻链的N 端氨基酸 序列以便设计相应的特异性引物。 表 1 4 . 3 . 2 所 有 方 案 的 疑 难 问 题 问题 可能原因 解决方法 基 本 方 案 1 第 一 次 PCR没有产物 第 一 次 PCR有非特异性条带 反转录或者PCR失败 用阳性对照模板检测试剂盒及试剂 RNA模 板 质 量 不 好 或 者 参 考 CPI单 元 10. IlRNA 提取正确的工作条件 降解 和注意事项 PCR反应没有优化 优 化 PCR反 应 ：MgCl2 浓 度 ，复 性 温 度 ，其他条 件 。如果其他条带不是很亮，问 题 不 大 ，因为通 过胶回收获得正确的PCR产物 第 一 次 PCR产物条带弥散 可能是引物和总RNA核 苷 从 总 RNA中纯化mRNA，参 考 CPI单 元 10. 11， 酸复性 基 本 方 案 8 组 装 PCR产 生 的 scFv产量 PCR反应没有优化 较低 优 化 PCR反 应 ：MgCl2 浓 度 ，复 性 温 度 ，其他条 件 。同样的条件和引物扩增组装scFv
    问题 可能原因 解决方法 基 本 方 案 1 电穿孔转化几乎没有得到克隆 最 后 一 步 纯 化 可 能 丢 失 每步都要电泳定量DNA。电泳比较连接产物和 scFv DNA 组成部分(质粒和插入DNA) scFv DNA没有充分酶切 在 2. 5 % 胶上 电 泳 ，比 较 消 化 的 DNA和未消化 DNA。 20〜40ngDNA电泳会得到细亮的条带。 可以分辨出几个碱基的差异 电穿孔细菌质量不好 用 1〜IOng超 螺 旋 质 粒 DNA作 对 照 ，检测细菌 的转化效率 PCR检 测 文 库 克 隆 ，产物偏短 大多数克隆文库克隆丢失 确 保 培 养 基 含 有 葡 萄 糖 （平 板 0 . 4 % ，培养液 (见辅助方案2) scFv插人 0. 1 % ) 除非 像YTAK特殊要求 文 库 克 隆 的PCR和指纹法分析 scFv克隆污染PCR反应 重 组 DNA过程中要严格操作。使用过滤枪头和 (见 辅 助 方 案 2),全部克隆显示 B对NI酶切图谱 基 本 方 案 2 一次性材料 第一轮富集基本没有得到克隆 TG~ 1 细 菌 丢 失 F 鞭 毛 ，不 挑取小平皿T O l 细 菌 ，培 养 要 低 于 37°C 。优化 能被产出噬菌体感染，抗原 ELISA包被和封闭缓冲液以及其他条件，免疫管 包被没有成功 也采用同样的条件 菌落太多(1〇 7) 免疫管没有充分封闭 优 化 ELISA包 被 和 封 闭 缓 冲 液 以 及 其 他 条 件 ， 免疫管也采用同样的条件 噬菌体没有充分封闭可能 会结合非特异性的抗原 用封闭液稀释噬菌体，免疫管也用同样的封闭液 富集过程中洗涤不充分 增加洗涤次数，PBST和 PBS各 2 0 次 第二轮富集产出没有增加 正常，因为比第一轮洗涤更 为严格 基 本 方 案 3 3 或 4 轮富集后没有检测到阳性 富集不充分 增加一轮富集。多 克 隆 噬 菌 体ELISA验证阳性 结合物 结合物的存在 单克隆 噬 菌 体ELISA确定的阳 scFv的筛选不够特异 很 多 scFv都 会 有 这 种 问 题 ，试试用细胞周质提 性 结 合物在可溶性scFv ELISA 中有信号 辅 助 方 案 3 取物代替待检培养基 生物素化抗原和链霉亲和素包 没 有 充 分 去 除 多 余 的 生 凝胶过滤层析（G-25柱 ，或 者 是 centricon 10/30 被珠子结合不充分 物素 单位)去除未接合的生物素 6 . 如果电泳结果正确，把剩下的P C R 产物跑胶，切取靶基因所在的位置， V h (第一管 和第二管）产 物 大 约 为 350b p ， V k (第三管和第四管）产 物 大 约 为 330b p 。进行胶 回收。 7•胶回收的D N A 溶 解 在 50M1 p H 8. 5 10m m o l / L Tris • C l 溶液里。 8 . 回收DNA 2 倍连续稀释，和大小一致并已知浓度的marker跑 胶 ，在紫外透照仪下 定量分析 D N A 片段浓度
    9 . 重新扩增胶回收的乂11和 V k •• 50/xl P C R 反应体系包含下列试剂： 50ng 模板 D N A 50pmol/反应引物混合物，引物比例见表14. 3. 1 1〜2U 高保真性D N A 聚 合 酶 （如 Vent D N A 聚合酶） 0. 2m m o l / L d N T P I X P C R 缓冲液。 除此之外，反应体系还应该包括： V h : 管 I : 50n g 产 物 1 作为模板，引 物 M u -V H l -6- B A C K (引 物 N o .1〜6 ) 和 M u -J H l - F O R (L ) (引物 N o .13)。 管 2: 50n g 产 物 2 作为模板，引 物 M n -V H l -6-B A C K (N o .l 〜6 ) 和 M u - J H 2- F O R (L ) (引物 N o .14)。 V k : 管 3 : 50呢 产 物 3作 为 模 板 ，引物以11， 10-7-： 8八0^0^)(引物^^〇 .24〜 3 0 ) 和 M u -J K l - F O R (L ) (引物 N o .32)。 管 2: 50n g 产 物 4 作 为 模 板 ，引 物 M u -V K l -7- B A C K (L ) ( 引 物 N o . 24〜3 0 ) 和 M u -J K 2- F O R (L )(引物 N o .33)。 1 0 . 扩增参数： 1 循环 5min 95°C预变性 3 0 循环 30s 95°C变性 Imin 55°C复性 Imin 72°C延伸 1 循环 5min 72°C产物延伸 样 品 4°C 保存。 11•电泳胶回收P C R 产物，定 量 （步 骤 6〜8)。 上述步骤扩增得到V h 库 带 3'端 的 2/3连接肽， V k 库 带 5'端 的 2/3连接肽。通 过重叠连接P C R 组装可变区获得全套scFv。 12. 组 装 反 应 如 下 （3〜5 个统一装配获得大量的scFv): 模板 ： 75n g 产 物 1 和 25n g 产 物 2, 75n g 产 物 3 和 25n g 产 物 4。 引物： 50pmol M u -Sfi-7- B A C K (L ) (引物 N o .9 ) 和 37. 5pmol M u -J K l - F O R (L ) (引物 N o .32)， 12. 5pmol M u -V K 2- F O R (L ) (引物 N o .33)。 50/xl反 应 体 系 包 含 1〜2U 耐 热 D N A 聚 合 酶 ， 0.2m m o l /L d N T P ， I X P C R 缓冲 液 。 13. 扩增设置参数： 1 循环 5min 95〇 C 预变性 3 0 循环 30s 95〇 C 变性 Imin 55〇 C 复性 Imin 72〇 C 延伸 1 循环 5min 72〇 C 产物延伸
    产 物 4°C 保存。 14. 取 5M 1产物， 1 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 （750b p)。 15. 胶回收P C R 产物，定 量 （步 骤 6〜8)。如 果 scFv D N A 为唯一的条带，可进行 P C R 回收，D N A 溶解在 50/^1 p H 7. 5 10m m o l / L Tris • Cl 溶液中。 16. 5U S / H 酶切 5M g 噬菌粒 D N A (如 p C A N T A B 5E ) 。 B S A 终浓度为 0 •l m g /m l 。 50°C 孵 育 3h 后 ，加 入 5U N 说I， 37°C 继 续 孵 育 2h 。其 中 N a C l 的 浓 度 为 100m m o l /L o 17. 1 % 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。切取目标条带，胶回收，定 量 （步 骤 6〜8)。 1 8 . 同步骤1 6 , 酶 切 scFv。无菌水代替洗脱液进行胶回收， D N A 溶 于 22M 1无菌水。 19. 配制连接反应体系（5 份）： IOOng S / zl+ A t o l 消化好的质粒D N A 8 0 ng S / il+ N o d 消化并纯化好的scFv 2 ^ 1 1 0 \ 连 接 缓 冲 液 Ijul T 4 D N A 连接酶 双蒸水补充至总体积为20M 1。 根据厂家推荐黏末端连接温度和时间， 16°C 或 者 4°C 孵 育 16h 。 20. P C R 回收连接产物，无菌水代替洗脱液，最 后 用50jlJ 无菌水溶解D N A 。 21. 制备电转的感受态菌E . c W T G l ( C P I 附 录 3N ) 或者是商业化的电转感受态菌 T G 1，准 备 2 0 个预冷的微量离心管，分 别 加 入 100/^1电转感受态菌液 T G 1 ，放在 冰上。 有 些 电 转 仪 已 经 有 预 先 设 置 的 程 序 ，如 果 没 有 的 话 ，参数应设为 2.5k V ， 25， ， 20〇 n 〇 2 2 . 准 备 2 0 管电转反应体系，每管加入2. 5； xl纯化好的连接产物和IOO1 Ltl电转感受态菌 液。加样器轻轻混合，冰上放置40〜50s。 2 3 . 转 移 D N A /细菌混合液到预冷的小槽内，立即放到电穿孔小室，冲 击 4〜5m s 。取 出小槽，立即加入900/xl预 热 到 室 温 的 S O C 培养基。用移液器上下混合，转移到 2 0 个 无 菌 13m l 离心管。 37°C 持续振摇孵育Ih (25〇 r/m i n)。 24. 从每管中吸取10M 1液体。 1 0 倍梯度稀释，涂到含抗生素的Y T A G 琼脂培养平板上 确定文库容量。 30°C 孵 育 16h 。 25•每个离心管室温， 5000g 离 心 10m i n ， lOOpl新 鲜 的 S O C 培养基重悬沉淀。分别涂 到 2 0 个 Y T A G 平 板 （p C A N T A B 5E 质粒含氨苄青霉素抗性基因）。 25°C 孵育16h 。 26 . 每块板子挑取单个菌落到10ml Y T A G 培养基。同 步 骤 2 5 , 离心收集细胞。 IOml 含 1 5 % 甘 油 的 Y T A G 培养基重悬。 1 0 倍梯度稀释转化细胞，涂 到 Y T A G 琼脂培 养平板上检测文库扩增程度25°C 培养过夜。其余分装 Iml/管 ， 一 80°C 保存。 文库应® 含 有 IO7〜IO8克隆。扩增后的文库应当含有101°〜IO11克隆形成单位 (C F U )A n l 0 质量评估：在检测文库容量的平板中挑取10〜2 0 个分离良好的克隆作为P C R 检测文库质量和差异的模板（见 辅 助 方 案 2)。如果是高质量的文库，每个克隆的 P C R 扩增产物都含有不同的限制酶酶切模式（R F L P )。
    基 本 方 案 2 scFv展示噬菌体在抗原包被板上的亲和筛选 预先准备所有的仪器和试剂。配制细菌生长培养基和平板备用。根据推荐步骤1 准 备大量辅助性噬菌体。仔细阅读下面所列的步骤以便更好的安排实验计划。 材 料 （带 V 项 目 见 附 录 1) 生长在小平皿上的T G -I 克隆 n/ Y T 培养基， 2 X (不含抗生素和葡萄糖） 细菌文库甘油冻存液（见基本方案1) Y T A G 培养基： 2 X Y T 培 养 基 ， 10(V g /m l 氨 苄 青 霉 素 和 1 % (m /V ) 葡萄糖 helper phage (如 V C S -M 13， Stratagene; M 13K 0 7 ， Bio-Rad 见辅助方案 1) Y T A K ±咅养基： 2 X Y T 培养基， lOOpg/m l 氨苄青霉素和50/xg/m l 卡那霉素 x/ P E G / N a C l V P B S 含/不 含 1 5 % (V /V ) 甘油 T G -I 细菌 Y T A G 培养平板： 2 X Y T 培养基， 100M g/m l 氨苄青霉素和0.4% (m /V ) 葡萄糖 特异性抗原， P B S 配制 V 碳酸氢钠缓冲液 2 % (W V ) M P B S : P B S 含 2 % (W V ) 脱脂奶粉。 4°C 最长储存48h P B S T : P B S 含 0 •0 5 % (V7 V ) T w e e n 20，室温保存 100m m o l /L 新鲜配置的三乙胺 x/ lmol/L Tris • C U p H 7. 4 Y T 培养基， 2 X ，含 1 5 % (V A O 甘油 4ml M a x i s o r p 免 疫 试 管 （N u n c ) ，或者是高亲和力蛋白的polystyrene管子 13ml polystyrene 管 £. coZi细菌培养 1 . 第一天：从 小 平 皿 上 挑 取 T G -I 菌 落 到 5m l 2 X Y T 培 养 基 中 ， 37°C 持续振摇培养 过夜。 丝状噬菌体通过性菌毛感染F + K c 0Zi (如 T G -I 菌株）。 E .c W f 必须在37°C 培养 处 于 对 数 生 长 期 （O D 6。。为 0.4〜0.6)，以保证性菌毛生长和转染效率。 2 . 第二天：菌 液 1: 100稀 释 到 20m l 新鲜配制的2 X Y T 培养基中。 37°C 持续振摇培养 直 至 O D 6。。为 0.4〜0.6。加入噬菌体感染。 菌液可在37°C 储存几个小时。不要放在冰上，这样会导致 F 性菌毛丢失和感染 效率降低。 P 携带细菌，比如 T G -I 应省在琼脂糖平狐上培养（如 M 9 培养基） 以避 免 P 丢失，造成细菌抵制纤丝状噬菌体的感染。
    噬菌体文库的培养和复苏 3 . 第一天：接种细菌文库储存液（约 1 X 101()个克隆）到 100m l 2 X Y T A G 培养基中， 37°C 持续振摇培养直至O D 議 为 0.5 (1.5〜2h )。 4. V C S -M 1 3 或 者 M 13K 0 7 辅助噬菌体感染细菌，比例为1 : 20 (细 菌 数 目 ：辅助噬菌 体颗粒， 1〇〇 6。。= 2 \ 1 0 8个细菌/!111)。 37°〇无振摇培养30111丨11，然后转入37°〇以 250r/m i n 的速度持续振摇继续培养30m i n o 5 . 转化细菌室温， 330(^离心10111丨11， 1001111¥丁八1^培养基重悬细菌， 301：持续振摇 培 养 过 夜 （250undefined/m i n)。 6 . 第二天： 4°C ， 8000g 离 心 IOmin (或 者 3300g ， lOmin) ，转移上清到新的离心管。 加 入 1/5体 积 的 P E G /N a C l 。混匀，冰 上 放 置 I h 以上。 4°C ， 10 8 0 ( % 离 心 30m i n ， 弃上清， 40m l 双蒸水重悬沉淀。加 入 8m l P E G /N a C l ，混勻 ，冰上放置20m i n 以上。 4°C ， 10 800g 离 心 l Omin。小心吸去上清。再次瞬时离心，尽可能吸干残留液体。 7. 5m l P B S 重悬沉淀，室温， 11 600g 离 心 l O min。噬菌体上清在4°C 可短期保存，在 含 1 5 % 甘 油 的 P B S 中，一70°C 可长期保存。新鲜复苏的噬菌体用来亲和筛选。 8 . 噬菌体的冻存液用无菌P B S 10倍梯度稀释，检测滴度。梯 度 稀 释 的 噬 菌 体 （从 IO7 开始）感 染 T C M (步骤2)，两者混合37eC 培 养 30m i n 。感染的细胞涂到 Y T A G 平 板上， 37°C 培养过夜。噬菌体冻存液的滴度应当为1〇 12〜1〇 13个细胞/m l 。 生物富集：第一轮筛选 9 . 第 二 天 ： 4m l 抗 原 （10〜 100/xg/m l 抗 原 ， P B S 配 制 ，或 者 50m m o l /L 碳酸氢钠 p H 9. 6 ) 包 被 N u n c 抗原管， 4〇 C 过 夜 （图 14. 3. 3)。 10. 第三天： P B S 快速洗三次，加 满 2 % M P B S 封闭。密封，室温或者37°C 孵 育 2h (根 据抗原的稳定性）。 P B S 洗三次。 11.加 入 IO11〜IO12复苏噻菌体到4ml 2 % M P B S 。室温在旋转器上孵育1〜2h 。每次清 洗都要用缓冲液完全填满管子，然后快速吸干。第一轮筛选，抗原管用P B S T 洗 10 次 ，然 后 用 P B S 洗 1 0 次去除清洁剂。第二轮及后面的筛选，抗原管用 P B S T 洗 20 次 ，然 后 用 P B S 洗 2 0 次 。 12. 加 入 l m l l O O m m o l /L 三乙胺，并继续在旋转器上孵育30m i n ，洗脱噬菌体。 13. I m l 噬菌体洗脱液立即加到预先准备的含〇• 5ml lmol/L P H 7. 4 Tris • C l 的管中快 速中和。 14. 洗脱后，向免疫管中再加入200/x l p H 7 . 4 的 lmol/L T r i s . Cl，中和管子残余的噬 菌体。旋转管子使得每部分都能接触到中和溶液。 15. 吸取步骤2 中 9. 25m l 处于对数生长期的T G -I 细菌，加 入 0.75m l 的已中和的噬菌 体洗脱液，同时在免疫管中也加入4m l T G ~l 细菌。 37°C 静 置 30m i n 。 16. 收 集 I O m l 和 4m l 噬菌体感染的T G -I 细菌。取 100M 1进 行 IO4〜IO5稀释。稀释液涂 于 Y T A G 平板。 37°C 培养过夜观测富集产出。 17. 剩下的丁0-1细菌室温， 330(^离心1〇 1^11。 111112\丫丁重悬细菌沉淀；分 涂 到 4 个 Y T A G 平板。 30°C 培养过夜或者可以见到克隆为止。
    图 14. 3, 3 固 相 抗 原 亲 和 层 析 （A) 或 者 是 溶 液 中 生 物 素 化 抗 原 富 集 scFv展示 噬 菌 体 （B) 。 多轮富集 18.第四天：在富集产出平板中加入5〜6m l 含 1 5 % 甘 油 的 2 X Y T 培养基，用接种环刮 下细菌。吸取50〜100/11菌液到1001111丫丁八〇培养基， 37°〇持续振摇（25(^/11^)
    培养直至〇 D _==0.5 (2h )，剩 下 的 菌 液 （产 出 1 甘油冻存液）一70°C 保存。 19. I O m l 菌液加入1/20(细菌数目/辅助噬菌体颗粒）辅助噬菌体。 37°C 孵 育 30m i n ， 然 后 37°C 持 续 振 摇 培 养 30m i n 。感 染 的 细 菌 室 温 ， 3300g 离 心 lOmin。 50ml Y T A K 培养基重悬细菌， 30°C 持续振摇培养过夜。 20•第五天：取 40m l 菌 液 4°C ， 10 800g 离 心 lO m i n，转移上清到新的离心管。加 入 1/ 5 体 积 （8m l ) 的 P E G /N a C l 。混勻，冰上放置I h 以上。 4°C ， 10 800g•离心lOmin。 小心吸去上清。瞬时离心，尽可能吸干P E G /N a C l 溶液。 2m l P B S 重悬沉淀， 4°C ， 11 600g 离 心 l O min，去除细菌碎片。 21. 滴度检测。 I m l 噬菌体溶液进入下一轮富集筛选（input)。另 外 Iml 4°C 保存。 22. 重复以上富集筛选步骤2 或 3 轮。每轮都要降低包被免疫管抗原的浓度。 监测富集筛淘投入和产出的比例。 下 降 的投入/产出比例表示成功的富集。多 克隆噬菌体E L I S A 检测特异性富集。一 轮 富 集 筛 选 需 要 2d 。通常可以通过观察 P E G /N a C l 沉淀颗粒的大 小 估计噬菌体滴度，这样就不需要多等一天来确定滴度。 每轮富集筛选得到的噬菌体种群结合特异性抗原， E L I S A 确定噬菌体的多克隆 抗体。 E L I S A 筛选噬菌体感染单细菌克隆，确定单克隆噬菌体抗体，电泳B ^ N I 酶 切 P C R 产 物 （见辅助方案2)，最后对 scFv D N A 进行测序可评估筛选得到的噬菌 体单克隆抗体的多样性。

    ​

    来源：丁香实验

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