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科研学霸天团，48小时有问必答

问一抗过程中无法足够一和目标蛋白结合 ? 细胞核显色不明显，靶细胞中没有目标蛋白? 切片本身脱蜡不彻底，如何解决?

郭郭的郭郭

1、洗涤不充分，膜没有洗干净。2、封闭不充分，一抗可能直接结合到膜上，造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。3、一抗/二抗浓度太高，出现非特异性结合。要解决封闭不充分这个问题，可尝试延长封闭时间，也可更换封闭液。常用的封闭剂有 5% 脱脂奶粉、5% BSA、血清和明胶等，推荐室温封闭 1 小时以减少背景。另外，脱脂奶粉常含有酪蛋白，由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此，检测磷酸化蛋白时建

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问二抗染坏了（非特结了），如何补救? 信号放大过度咋整? 染料和pbs在组织中互相作用的正确步骤?

dxywode

1) 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7．4)冲洗三次，每次3分钟(3×3’)。　　2) 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。　　3) 每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。　　4) PBS冲洗3×3’。　　5) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。　　6) 甩去血清

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问同一样品多次ELISA检测，测试结果差异大怎么解决？

peaceful13

样本的保存会影响蛋白的含量，尽量减少样本的反复冻融，并且测试时间间隔不可过长；其次elisa实验其实很多的是看样品含量趋势比较，如果要测试多次elisa实验的检测结果，那么最好有个校准的标品，再每次elisa实验时，校准产品检测出来的值差异需要在控制范围，这样确保实验间的差异变化也不过多影响最终样品值的确定

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问用血清孵育过的细菌，不孵一抗，只用FITC标记的抗鼠的二抗孵育，当做阴性对照，阴性值特别高，请问是血清中的什么东西能与二抗反应吗

dxywode

免疫组化中的封闭血清，不能选择和一抗同源的，否则会出现假阳性；因为二抗会和血清中的Ig反应。而免疫组化的替代对照里，用的也是和实验一抗同源的血清，出来的结果理论上却应该是阴性的——说明阳性结果是与特异性抗体结合产生的，而不是血清中存在的。

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问如果是做多克隆抗体，是免疫兔子好还是免疫老鼠好呢？如果是免疫老鼠，对小白鼠的品种有要求吗？

郭郭的郭郭

多克隆抗体一般通过免疫接种合适的哺乳类动物而产生，例如小鼠、兔子或者山羊。通常更倾向于采用大型哺乳类动物，因为可以采集更多的血清。一般选择兔子比较多，如果是老鼠的话，对种类一般没有要求。

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问石蜡切片抗体结合是否需要温箱孵育？

c_Yeats

1.一般一抗4℃过夜，二抗室温2.可以脱色后复染看看

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问流式细胞术检测NK细胞杀伤功能，如何精确检测杀伤效率。

txs900416

NK92细胞的杀伤功能取决于NK细胞的细胞状态及靶细胞的细胞状态，建议将细胞状态调整到一致再做重复实验。此外，合理标记靶细胞（例如使用CTV或CFSE染料）进行合理的靶细胞圈门可以区分效应细胞和靶细胞。杀伤时间和效靶比都需要预实验探索

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问Western blot 中背景强

颜渊溪桥

1%t tween+5%peptone tbst/pbst 配置，室温封闭1h,铅笔标记下marker，会洗没的；含0.1%tween上抗体。

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问ELIISA全菌包被检某个蛋白的时候，阴性对照特别高，怎么办

郭郭的郭郭

ELISA的前带效应。前带效应（或后带效应）其实是由测量程序的固有属性产生。对于所有测量程序而言，都有分析测量区间（analytical measurement interval，AMI）这一个重要属性。两个思路：1. 优化测量程序，拓宽AMI，通过提高原料用量或者改进包被工艺，使目标浓度进入AMI以内；2. 建立稀释方案，通过稀释使目标浓度降至分析测量区间以内，再对其进行检测。第二种思路其实是在

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问做COIP实验，互作的两个蛋白在目标位置有条带，但是阴性对照（NC）在相同蛋白分子量的位置也出现了浅条带，是什么原因？怎么改善？

小暮

阴性不应该有条带，有条带就是有结合，这个说明抗体有非特异结合的可能：1.抗体特异性不够，如果反复多次阴性对照出现条带考虑，更换抗体。2.上样错误，仅表现一次阴性对照阳性，重复实验就行

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问免疫荧光中DAPI 信号过强甚至看不清细胞核轮廓和核仁是什么情况？

dxywode

1.组织切片太厚：这种情况下可以选择将组织切片变薄试试。2.封闭不佳:封闭的目的就是为了减少非特异性的结合，减少背景染色。如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。

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问Western Blot转膜失败是为什么

小暮

(1) 膜没有完全均匀湿透使用 100% methanol 浸透膜。(2) 靶蛋白分子量小于 10 000选择小孔径的膜，缩短转移时间。(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。(4) 甲醇浓度过高过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分

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问流式细胞术单细胞悬液制备如何获得更明显的分群？

txs900416

T细胞染色要看T细胞的富集程度，例如淋巴器官中，若不分群，主要考虑细胞量过大抗体量不足；若TIL或者其他组织中来源T细胞，还需要考虑细胞分离不好、T细胞丰度较低的因素，建议去除实质细胞背景，加染白细胞标志CD45，圈出cd45阳性细胞群再分析。

4 回答850 围观

问大鼠中酶联免疫吸附试验的血清用量是多少？

txs900416

取决于检测的目的蛋白含量和试剂盒的检测限，例如用klh免疫大鼠，测igg和igm就需要进行十倍和百倍的稀释，对照组则不用稀释；例如测血清中细胞因子，基本不用稀释，可用原液测。一般使用96孔平板加入的稀释好的样品体积为200ul。

2 回答98 围观

问柱层析纯化抗体问题解答

府宅

色谱柱填装紧与否对分离效果很有影响，若松紧不均，特别是有断层时，影响流速zhi和色带的均匀，但如果装时过分敲击，色谱柱填装过紧，又使流速太慢。影响层析柱整体渗透速度分布不均，致使色素带不是整齐的环状色素带，进而增长分离各色素的时间，应在装填层析柱前用适量的丙酮润洗一下，后在装入氧化铝时应边加边敲打层析柱使氧化铝殷实，然后用真空抽滤方法，用乙醚进行抽滤至无气泡为止。

2 回答126 围观

问重复性较差，做了两个复孔值相差太大，是什么原因？

dxywode

1、样品数量多少不一，加样时间有长有短；所以重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近。2、保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致；重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性。3、加样量不一致；样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。

3 回答79 围观

问花板实验终止后，整板结果呈现均一的黄色或淡黄色，或阴阳性对照、质控正常，阴性标本OD值过高。是什么原因？

dxywode

: ①整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成。②酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象。③孵育温度过高或孵育时间过长。④未按要求洗板，用自来水或其他公司洗液洗板，特别是洗液时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象。⑤阴阳性对照、质控正常，阴性标本OD 值过高的情况称为花板，一般是由于标本的收集、处理和保存方法不当，洗板不切底、显色时间延长造成。

1 回答56 围观

问Elisa测定中出现了问题，可能会有哪些原因呢

dxywode

标准曲线较差、无信号、变异系数较大

3 回答82 围观

问染色质为什么要片段化，片段化长度是多少

府宅

一般片段化的大小在200-1000bp，一般300-600bp均能获得较好的ChIP结果。如果小于200bp的话，蛋白的结合位点很有可能被打断，原因是由于每个核小体结合DNA的序列长度为175bp，加上不同核小体间的linker DNA序列，这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右，如果片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含目标序列的DNA，但所要研究的蛋白可能会离您目标序列有

2 回答120 围观

问石蜡切片在染色过程中总出现脱片现象的原因是？

LLLLDL

1.多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。2.组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切得厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3.组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。4.没烤好，时间短温度不够之类。

3 回答133 围观

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