求助 | Ficoll密度梯度离心法分离PBMC 在离心管底出现细胞膜 吹不开

把血液加入淋巴细胞分离液一步非常关键，必须要保持液面的平衡，要将离心管口45度倾斜，然后以非常慢的速度，一滴一滴的靠着离心管内壁加进去，慢慢的加入几滴形成一个界面，全过程需要很稳定的手法。

1、初始PBMC估计1毫升可以分出来100万个细胞。

常规5 ml外周血可以分到undefined10^6-undefined10^7 cell，按照自己所需确定外周血体积。

2、分离液与稀释后的血液比为1：2。外周血获得后进行密度梯度离心，最好将其按照1：1的比例进行稀释，这样分离效果会大大提高。700g到1000g都可以，800到900g的分离率最高(undefined2.5=rpm,即2000-2500rpm)，离心的时候需要刹车，升速正常，但是降速为0。

因为血液中各有形成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得PBMC。一般为用水平离心机以2500rpm/min（具体看型号，换算成g的话是1000g的样子）离心20min。这个离心是比较关键的。

分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱，影响后面的实验结果。