Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

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　　测定细胞免疫 功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
　　(一)　原理:
　　常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子 量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
　　(二)　方法:
　　1.　在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
　　2.　取肝素抗凝静脉血与等量Hank"s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
　　3.　离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank"s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
　　4.　用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank"s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
　　5.　末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
　　单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
　　　　　　　　　4个大方格内细胞总数
　　　　　　　　　──────────　×　10４×2(稀释倍数)
　　　　　　　　　　　　　　4
　　6.　细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
　　　　　　　　　　　　　活细胞数
　　　　　活细胞百分率＝──────　×100％
　　　　　　　　　　　　　总细胞数
　　用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。　　 (三)　试剂和材料:
　　比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
　　Hank"s液(无Ca２＋、Mg２＋)
　　10％小牛血清RPMI1640
　　0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS 配制。
　　肝素用Hank"s液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。
　　短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
　　无菌干燥注射器针头。
　　碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
　　血球计数板、显微镜、水平式离心机。
　　(四)　注意事项:
　　1.　抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
　　2.　操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
　　3.　用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
　　4.　小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。