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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

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  测定细胞免疫 功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的,采用不同方法,考虑(1)细胞纯度;(2)细胞获得量;(3)细胞活力;(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
  (一) 原理:
  常用来分离人外周血单个核细胞(PBMC)的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,犌W水性高,平均分子 量为400,000,当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。
  (二) 方法:
  1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
  2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank"s液或RPMI1640充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
  3. 离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank"s液,下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图),单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有血小板。
  4. 用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一短中管中,加入5倍以上体积的Hank"s液或RPMI1640,1500rpm×10分钟,洗涤细胞两次。
  5. 末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。
  单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)=
         4个大方格内细胞总数
         ────────── × 104×2(稀释倍数)
              4
  6. 细胞活力检测:死的细胞可被染成兰色,活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
             活细胞数
     活细胞百分率=────── ×100%
             总细胞数
  用本法分离PBMC,纯度在90%以上,收获率可达80~90%,活细胞百分率在95%以上。   (三) 试剂和材料:
  比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
  Hank"s液(无Ca2+、Mg2+)
  10%小牛血清RPMI1640
  0.2%台酚兰染色液,用生理盐水或等渗的PBS 配制。
  肝素用Hank"s液或生理盐水稀释成500单位/ml,牽9凝人外周血肝素用量约为50单位/1毫升血。
  短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
  无菌干燥注射器针头。
  碘酒,75%酒精,无菌棉球,镊子,橡皮止血带。
  血球计数板、显微镜、水平式离心机。
  (四) 注意事项:
  1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
  2. 操作全程应尽可能短时间内完成,以免增加死细胞数。
  3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时,离心机转速的增加和减少要均匀、平稳,使保持清晰的界面。
  4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同,犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。

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