原理
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，水性高，平均分子量为400000，当密度为1.2 g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
材料与仪器
淋巴细胞分离液 血清 肝素
肝素 Hank's液 PBS
滴管 吸管 针头 碘酒 酒精 棉球 止血带 计数板 显微镜 离心机
肝素 Hank's液 PBS
滴管 吸管 针头 碘酒 酒精 棉球 止血带 计数板 显微镜 离心机
步骤
1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000 rpm×20 分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5 倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10 分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10 ％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2 ％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
6. 细胞活力检测
死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000 rpm×20 分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5 倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10 分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10 ％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2 ％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
4个大方格内细胞总数
单个核细胞浓度（细胞数/1 毫升细胞悬液）＝────────×104×2（稀释倍数）
4
6. 细胞活力检测
死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
活细胞数
活细胞百分率＝────── ×100 ％
总细胞数
用本法分离PBMC，纯度在90 ％以上，收获率可达80～90 ％，活细胞百分率在90 ％以上。
注意事项
1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
常见问题
一、附录
1. Hank's液（无Ca2＋、Mg2＋）配制法
NaCl 8.0 克，KCl 0.4 克，Na2HPO4·12H2O 0.12 克，KH2HPO40.06 克，葡萄糖1.0 克，双蒸水1000 毫克，1％酚红液2 毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500 毫升盐水瓶内，8 磅15 分钟灭菌，4 ℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
2. 细胞分层液配制法
9 ％聚蔗糖24 份，34 ％泛影葡胺10 ％
混合，测比重为1.077～1.078，G5玻璃滤器过滤除菌。4 ℃冰箱保存备用。
3. 磷酸缓冲液（PB）
原液
A液
0.2 M NaH2PO4溶液，NaH2PO4 27.6 克，或NaH2PO4·2H2O 31.2 克，蒸馏水，溶解至1000 毫升
B液
0.2 M Ha2HPO4溶液，Ha2HPO4·12H2O 71.6 克，蒸馏水溶解至1000 毫升
各种不同PH值PB的配法
举例
0.1 M PH7.2PB
4. 血球保存液
葡萄糖2.05 克，枸椽酸钠0.8 克，氯化钠0.42 克，蒸馏水100 毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶（100毫升）。经10 磅、10 分钟高压灭菌。4 ℃保存备用。
5. 培养液配置
（1）RPMI-1640培养液
（2）不完全RPMI-1640培养液
（3）完全RPMI-1640培养液
1. Hank's液（无Ca2＋、Mg2＋）配制法
NaCl 8.0 克，KCl 0.4 克，Na2HPO4·12H2O 0.12 克，KH2HPO40.06 克，葡萄糖1.0 克，双蒸水1000 毫克，1％酚红液2 毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500 毫升盐水瓶内，8 磅15 分钟灭菌，4 ℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
2. 细胞分层液配制法
9 ％聚蔗糖24 份，34 ％泛影葡胺10 ％
混合，测比重为1.077～1.078，G5玻璃滤器过滤除菌。4 ℃冰箱保存备用。
3. 磷酸缓冲液（PB）
原液
A液
0.2 M NaH2PO4溶液，NaH2PO4 27.6 克，或NaH2PO4·2H2O 31.2 克，蒸馏水，溶解至1000 毫升
B液
0.2 M Ha2HPO4溶液，Ha2HPO4·12H2O 71.6 克，蒸馏水溶解至1000 毫升
各种不同PH值PB的配法
───────────────────────────────────────
PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液（ml） 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液（ml） 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
举例
0.1 M PH7.2PB
A液28 毫升，B液72 毫升，加蒸馏水100 ml
4. 血球保存液
葡萄糖2.05 克，枸椽酸钠0.8 克，氯化钠0.42 克，蒸馏水100 毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶（100毫升）。经10 磅、10 分钟高压灭菌。4 ℃保存备用。
5. 培养液配置
RPMT-1640（FLOW公司出品）1 袋，三蒸水1000 毫升，电磁搅拌30 分钟：1N HCl 调PH7.2～7.4（约加2.5 毫升），过滤除菌，作无菌试验，4 ℃保存。
（2）不完全RPMI-1640培养液
RPMI-1640 95 毫升，0.1M丙酮酸钠 1 毫升，0.2 M谷氨酰胺 1 毫升，1 M Hepes 1 毫升，7.5 ％ NaHCO3 1 毫升，青霉素、链霉素（各1万单位）1 毫升
（3）完全RPMI-1640培养液
不完全1640培养液90 毫升，灭活胎牛（或新生牛）血清10 毫升
来源：丁香实验
