原理
FicoH-Hypaque(又称淋巴细胞分层液)梯度离心法是一种单次密度梯度离心分离法。
实验采用FicoH-Hypaque分层液。蔗糖聚合物称聚蔗糖(商品名为Ficoll),分子量为40kD,具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高,易使细胞聚集,使用60g/L的低浓度Ficoll溶液,添加泛影葡胺(urografin)(国外常用商品Isopaque或Hypaque,故又称Ficoll-Hypaque分层液),可配制成密度合适分层液。
因为人的红细胞密度为1.093,粒细胞密度为1.092,单个核细胞在1.076——1.090之间,所以密度为1.077±0.001的分层液最佳。
分离时各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部,而红细胞与粒细胞密度较大,沉于分层液底部。外周血单个核细胞(PBMC)密度稍低于分层液,故位于分层液界面上,这样就可以得到PBMC。
材料与仪器
PBS 聚蔗糖-泛影葡胺溶液 HBSS 磷酸缓冲盐溶液 淋巴细胞分层液
刻度离心管 吸管 试管 毛细吸管 橡皮乳头 载玻片 盖玻片 水平式离心机
步骤
1.静脉取血2ml,加入含肝素溶液(10——50u/ml血样本)的试管中,混匀,使血抗凝。用PH7.2的Hanks液将抗凝血稀释一倍。
2.吸取2ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中,将离心管倾斜45°角,用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面,应注意保持液面清晰。
3.在18℃——20℃下,用水平离心机以2000r/min离心20min。
4.用毛细吸管轻轻插入混浊带,沿管壁轻轻吸出单个核细胞层的细胞,移入另一支离心管中。避免吸取过多的分层液或血浆。
5.用Hanks液洗涤细胞3次,第1次2000r/min,进行10min。第2——3次1500r/min,进行10min。可去除大部分混杂的血小板。
6.将沉淀细胞悬于培养基中备用。
注意事项
1.实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时,上述操作过程都要在无菌条件下进行,所用器材,试剂都应为无菌。
2.实验中的细胞获得率与室温及分层液比重等有关,分层液应避光4℃保存。
3.往淋巴细胞分层液中加入稀释全血时,不得将血液冲入分层液中,需保持两层液体的清晰界面。
常见问题
此法分离PBMC纯度可达95%,淋巴细胞约占90%,其中T淋巴细胞占80%,B淋巴细胞占4%~10%。
本实验来自《精编免疫学实验指南》作者:J.E.科利根等,译者:曹雪涛等。
来源:丁香实验