Ficoll-Hypaque梯度离心法（单个核细胞）

FicoH-Hypaque（又称淋巴细胞分层液）梯度离心法是一种单次密度梯度离心分离法。

实验采用FicoH-Hypaque分层液。蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，使用60g/L的低浓度Ficoll溶液，添加泛影葡胺（urografin）（国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液），可配制成密度合适分层液。

因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076——1.090之间，所以密度为1.077±0.001的分层液最佳。

分离时各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部，而红细胞与粒细胞密度较大，沉于分层液底部。外周血单个核细胞（PBMC）密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可以得到PBMC。

肝素抗凝血或肝素化的脐带血
PBS 聚蔗糖-泛影葡胺溶液 HBSS 磷酸缓冲盐溶液 淋巴细胞分层液
刻度离心管 吸管 试管 毛细吸管 橡皮乳头 载玻片 盖玻片 水平式离心机

1.静脉取血2ml，加入含肝素溶液（10——50u/ml血样本）的试管中，混匀，使血抗凝。用PH7.2的Hanks液将抗凝血稀释一倍。

2.吸取2ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，将离心管倾斜45°角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持液面清晰。

3.在18℃——20℃下，用水平离心机以2000r/min离心20min。

4.用毛细吸管轻轻插入混浊带，沿管壁轻轻吸出单个核细胞层的细胞，移入另一支离心管中。避免吸取过多的分层液或血浆。

5.用Hanks液洗涤细胞3次，第1次2000r/min,进行10min。第2——3次1500r/min,进行10min。可去除大部分混杂的血小板。

6.将沉淀细胞悬于培养基中备用。

1.实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时，上述操作过程都要在无菌条件下进行，所用器材，试剂都应为无菌。

2.实验中的细胞获得率与室温及分层液比重等有关，分层液应避光4℃保存。

3.往淋巴细胞分层液中加入稀释全血时，不得将血液冲入分层液中，需保持两层液体的清晰界面。

1. 此法分离PBMC纯度可达95%，淋巴细胞约占90%，其中T淋巴细胞占80%，B淋巴细胞占4%~10%。
   
   

2. 本实验来自《精编免疫学实验指南》作者：J.E.科利根等,译者：曹雪涛等。