Ficoll密度梯度离心法提取PBMC原理及注意事项

Ficoll密度梯度离心法提取PBMC原理及注意事项

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。PBMC 可利用健康人或动物供体的外周血，通过 Ficoll 密度梯度离心，磁珠分选等步骤获得，主要包括淋巴细胞和单核细胞。

Ficoll 是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量 400,000，当密度为 1.2 g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

人 PBMC 中不同细胞类型的比例
PBMC 中大部分都是淋巴细胞，包括 B 细胞和 T 细胞，其中 CD3 T 细胞又占了淋巴细胞中绝大部分 (45 - 70%)。这些 T 细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始 T 细胞会因抗原识别而被激活。同样的 B 细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在 10 - 30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞 (DC) 或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有 0.1 - 0.2%，因此很难从全血样本中分离到。

一、外周血单个核细胞（PBMC）制备方法
1. 设备与试剂
全血（以 10 ml 为例）
无菌 PBS 溶液 (pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17 - 1440 - 02)
RPMI 1640 培养基（Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
双抗 P/S（Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒

2. 方法/步骤
配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640 + 10% FBS+ 1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS 中加入 10%DMSO；

（1）在离心管中加入淋巴细胞分离液 Ficoll
（2）取抗凝外周血（全血）与无菌 PBS 按照 1:1 充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为 1:1:1。
（3）水平离心 400 g 成×30 分钟（可根据淋巴细胞分离液 Ficoll 或离心机转子要求调整）
（4）离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和 PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，主要就是单个核细胞，包括淋巴细胞与单核细胞。此外，还含有血小板。
（5）去除部分上层液体，余下约 1 mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入 5 倍以上体积的 PBS，离心 300 g×10 分钟，洗涤细胞两次。
（6）末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育 2 分钟，裂解红细胞，可根据情况适当增减时间。
（7）加入 10 mLPBS，离心 300 g×10 分钟，洗涤细胞两次。
（8）末次离心后，弃上清，加入含有 10%FBS 的 RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。

注意事项
全血溶液可以加在 Ficoll 上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离 PBMC 第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。

细胞运输与保存
（1）干冰运输，收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏；
（2）T25 瓶运输细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存，具体操作步骤见细胞培养步骤。

PBMC 收到后注意事项：
（1）收到 PBMC 细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时反馈。
（2）先不打开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时，稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。
（3）静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。
（4）贴壁细胞：若细胞密度超过 80%，可正常传代；若未超过 80%，收集细胞瓶内的培养基，留 8 ml 继续培养至 80% 左右再传代，瓶盖可稍微拧松。
（5）细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后 4℃ 保存备用，可补加 2% 血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。
（6）细胞胰酶消化液建议使用 PBS 配制。

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不同种属 PBMC：人，猴，犬，大鼠，小鼠
人外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen
猴外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen
比格犬外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen
大鼠外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen
小鼠外周血单个核细胞 PBMC Fresh/Frozen