利用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
互联网
实验原理
实验试剂
1. Hank's液(无Ca２＋ 、Mg２＋ )配制法
NaCl 8.0克
KCl 0.4克
Na２ HPO４ ·12H２ O 0.12克
KH２ HPO４ 0.06克
葡萄糖 1.0克
双蒸水 1000毫克
1％酚红液 2毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
2. 细胞分层液配制法
9％聚蔗糖 24份
34％泛影葡胺 10％
混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。
4. 血球保存液
葡萄糖 2.05克 枸椽酸钠 0.8克
氯化钠 0.42克 蒸馏水 100毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4℃保存备用。
实验设备
1. 短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
2. 无菌干燥注射器针头。
3. 碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
4. 血球计数板、显微镜、水平式离心机。
实验材料
实验步骤
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
4个大方格内细胞总数
────────── × 10４×2(稀释倍数)
4
注意事项
