【求助】泛素化出不来！

临床本科，目前在导师实验室做泛素化实验，依照老板paper上的方法多次重复，但均没有出现预期条带，求大牛学长学姐帮助。 我用的Flag-X和HA-Ub磷酸钙共转293T，一般都是36小时收细胞，收细胞前8小时加MG132（5微M），裂解，加Flag-M2 beads，洗脱3小时，最后孵anti-HA，但是预期的拖尾条带根本没有出现过。 是泛素化实验有哪些需要注意的地方我没有做到么？满地打滚求帮忙！