太郁了，怎么都出不来，请大家分析分析

我在克隆一个基因，以前的师姐做出来了，由于找不到原来的引物，我又重新设计，前后设计了两引物，用primer5检测都很好，就是P不出来，请各位高手指教，究竟哪里出了问题。
附上我的基因mRNA及我所设计的引物，反应参数等条件。
mRNA序列：其中CDS在315－587
1 ctgcgcagat gaggggagac tcgtcaccag gcgtgcagtg ggcactgctg ggctccccca
61 tcccgtccta acccggaaca gccccgggca ggaggcgtgg aaagtcgagg gggtaaaccg
121 cgaatgtgcg ttgtgtaagc cacggcgcag ggtggggcgc gggcgggact tgggcgggcg
181 gggtgggctt ggccgagctg gcctccgggg caccgaccgc tataaggcca gtcggactgc
241 gacacagccc atcccctcga ccgctcgcgt cgcatttggc cgcctcccta ccgctccaag
301 cccagccctc agccatggca tgccccctgg atcaggccat tggcctcctc gtggccatct
361 tccacaagta ctccggcagg gagggtgaca agcacaccct gagcaagaag gagctgaagg
421 agctgatcca gaaggagctc accattggct cgaagctgca ggatgctgaa attgcaaggc
481 tgatggaaga cttggaccgg aacaaggacc aggaggtgaa cttccaggag tatgtcacct
541 tcctgggggc cttggctttg atctacaatg aagccctcaa gggctgaaaa taaataggga
601 agatggagac accctctggg ggtcctctct gagtcaaatc cagtggtggg taattgtaca
661 ataaattttt tttggtcaaa ttt
引物：
1 sense　　 121 　5' CGAATGTGCGTTGTGTAAGC 3'
2 anti　　　 654 　3' GTTTAGGTCACCACCCATTA 5'
其中：121　　20bp Tm57.5 GC% 50
654 20bp Tm 54.7 GC% 45
反应参数：P1　1ul
P2 1ul
template 2ul
undefinedmaster 10ul
ddH20 6ul
反应条件：95　5min
95 30S
50 30S
72 1min
共30次
　　　　72 10min
其中退火温度试过了47、50均未出结果。不知该如何？