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科研学霸天团，48小时有问必答

问免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？

天一湖医者

可以，如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

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问上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果？

天一湖医者

无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。

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问我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？

天一湖医者

1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系； 2）也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。

4 回答97 围观

问一般一抗和二抗是用什么稀释的呀？

天一湖医者

PBS稀释。当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。上网查一下，有很多protocol。一般一比几百到一万都有，依抗体而定。可以4度过夜，这样染色效果好。二抗一般较便宜，一般1：50到1：200多。

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问提取蛋白后浓度显示基本正常，但是转膜后丽春红染色看不到蛋白的位置，有marker，这是怎么回事呢？

天一湖医者

可能是转膜没转过去，或者转过了。你电转缓冲体系有问题，可以试着加点SDS，会好一点。

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问在封闭之前膜需要漂洗吗？是用什么漂洗呀？

天一湖医者

不用洗的，封闭前后都不要洗，封闭后的更没有必要洗，因为我们的抗体就是用封闭液来配的。效果都很好！

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问IP后的蛋白洗脱液有60ul，要跑WB的话用多少合适？

balalaLy

比如我用2个100cm皿的细胞拉的蛋白可以按照10ul左右的上样量跑，大多数蛋白都可以跑出来

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问WB和切片灌流区别

bamboopiggy

pbs的缓冲效果很好，生理盐水也可以，有哪种，用哪种吧。但是一定注意要用冷的液体，防止蛋白降解。

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问用bradford法定量蛋白的时候，用紫外分光光度计做线性的时候，相关系数总是做的不好，有没有相似经验的？

dxy_emzv2873

首先，实验习惯很重要，用枪的手法也是有标准的，可以去搜搜，保证稀释浓度准确。其次，样品用的什么溶剂，标准品也用什么溶剂溶解，保持一致。还有一点很重要，但是经常被忽视的：溶液里有些物质会对bradford法有影响。bradford法不受还原试剂的影响，样品中β–巯基乙醇的浓度可高达1M，DTT浓度的可高达5mM。但会收到略高浓度的去垢剂的影响，需要确保SDS低于0.01%，Triton X-100低

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问Western Blot转膜效率低怎么办？

Eason老歌迷

你是用的半干转还是湿转，你的蛋白是多少呢？如果要是大蛋白可以试一试湿转，效果更好。你的转膜液用几次更换呢？也可以增加转膜时间试一试。

4 回答80 围观

问WB实验显色或曝光后无条带原因在哪儿？

Eason老歌迷

可能有几个原因，一个是你的转膜没转好，或者是转膜时间太长转过了。二个是你剪膜直接把目的条带剪掉了。三可能是你孵抗体没孵好，或者是一抗二抗选错了。四可能是你的显影操作有问题

3 回答61 围观

问Western blot实验时背景高且不均匀怎么办？

天一湖医者

封闭物用量不足，提高封闭浓度，使用适当体积保证孵育时完全覆盖。转印膜封闭物使用不当，检测生物素标记的蛋白时，不可用脱脂奶封闭。封闭的时间不够，延长封闭时间，抗体非特异性结合减少，抗体的浓度和孵育时间抗体浓度过高或洗涤不彻底，降低抗体浓度，增加洗涤时间和次数化学显色底物过多减少显色底物用量

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问WB实验时目的蛋白信号弱怎么办？

林夕娜娜

1.加大上样量2.使用高灵敏度的发光液。

4 回答71 围观

问westernblot配胶问题

Eason老歌迷

没啥区别，我都是用过的。之前用无水乙醇，后来该用的水。无水乙醇效果更好一丢丢

3 回答105 围观

问wb检测蛋白时，过曝的话，结果还可信吗？

Eason老歌迷

建议你重新跑吧。要么降低一下你的上样量，或者是稀释你的抗体倍数，或者是减少你的曝光时间

3 回答53 围观

问买的抗体，说明书里图片显示目的条带只有一条，而自己做wb，却有多条带，什么原因呢？

balalaLy

有些时候是会这样，要调整一下抗体的浓度、稀释液、还有孵育时间。

6 回答56 围观

问WB检测蛋白，条带大小与理论大小不相符，什么原因？

Eason老歌迷

如果蛋白大小和预测值有明显倍数关系，那就要考虑一下这个蛋白是不是二聚体或者多聚体啦。

3 回答90 围观

问WB实验跑出来的目标条带信号很弱是怎么回事

爱我家的肉肉

提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流抑制剂）。一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜，或者是由于二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-2

6 回答102 围观

问每次曝出来的片总是中间空心，想不通是为什么

Eason老歌迷

可能是你转膜的时候，你的膜和胶之间有气泡，你没赶走。

3 回答36 围观

问BCA调完上样内参还是不齐什么原因

Eason老歌迷

调整上样量，如果还是调不齐，建议做灰度扫描，将目的蛋白的灰度值比上对应的内参，这样比较准确，目前很多文章的western图都会附上相应的灰度扫描结果，这样更加定量和直观。或者你配的胶的问题，可能没凝好。

3 回答130 围观

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