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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
小分子量的蛋白 用15%的胶可以分出来吗?条带大小7KD
秋秋欣欣
15%的胶最佳分离范围为10-40kda, 应该也可以的
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问
封闭之后,需要洗膜吗?
天一湖医者
需要,封闭完成后要进行洗膜,以去除膜上未结合的封闭试剂
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问
收细胞样本时候看着很多,每组加30微升裂解液裂解细胞提蛋白后BCA定量蛋白浓度低,原因?
inventbiotech
如果是在板子里直接进行细胞裂解蛋白提取,样品很多是,裂解液粘稠糊在板子上会影响蛋白得率,板子上直接操作,还会存在因裂解液不强导致的细胞未被裂解,致使蛋白浓度过低。
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问
到底是应该选择半干转还是湿转?
n0y0j7
对于需要加长时间进行转移的大蛋白而言,湿转移更适合。半干时间短,省转膜液
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问
请问,为何细胞里和组织里相同蛋白跑出来的位置不一样? 所配的胶等步骤都是一样,而且重复过很多次。
bamboopiggy
你细胞和你的组织是一个种属的?是同一个器官的?不同器官收的蛋白样,可能跑的位置也不一样。
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问
目的条带时而清晰,时而不存在怎么办?一样的实验条件
inventbiotech
一时可以检测到一时检测不到,可能是样品在进行蛋白抽提时有蛋白丢失导致的,尤其是目标蛋白定位于细胞膜细胞器细胞核等位置上的蛋白,容易发生丢失。当然还有有可能是转膜失败,WB检测过程可以设置质控点,丽春红染色检查转膜是否成功。一步步分析看看原因出在哪里,如果是不是WB检测的问题,那就是蛋白提取的问题,如果是的话,建议使用柱式法总蛋白进行蛋白提取,可以解决这个蛋白丢失问题
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问
转膜后,如何选择抗体,敷抗体的时间怎么把握?
Eason老歌迷
根据你跑的目的蛋白选择一抗,然后二抗的话就根据你选的一抗种属来选择,一抗是鼠的就选抗鼠,一抗是兔的就选抗兔。一抗一般都是4℃孵育过夜。然后二抗常温孵育1.5h,别孵育太久。你可以做几次预实验,调整一下孵育时间,看看什么时间最合适。
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问
BCA法蛋白定量后,内参条带仍然不齐,怎么办?
蜡笔小迟
组织定量本来靠测浓度就不准,建议:先测浓度,按浓度跑内参,然后按内参灰度调整上样量。
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问
蛋白显影拍出来黑乎乎,不明显是什么原因?
Eason老歌迷
可能是你的封闭时间太短了。也可能是你的抗体浓度太高了,或者孵育时间太长了。
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问
为什么有时候WB显影出来的结果跟说明书上的不同?
Eason老歌迷
因为实验条件不一样,肯定会有或多或少的差别,只要不是太大就行。
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问
加入碧云天5x上缓冲液变性后,上样会漂样怎么办?
dxy_zb3k48t2
我之前电泳缓冲液忘了稀释直接用的5x 样品就漂起来了
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问
目前脱脂奶粉封闭,条带背景不是很干净,封闭时究竟是选脱脂奶粉、BSA还是商品化的快速封闭液更好呢?
Eason老歌迷
我觉得脱脂奶粉效果更好,你可以封闭时间长一点,这样会更干净。
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问
为什么同一个指标,不同公司的抗体条带位置不一样,有四十几,有五十几版本,如果两个抗体一起孵,不得有两个目的条带吗?
Eason老歌迷
不同公司的抗体,肯定是多多少少有点不一样。如果你两个抗体一起孵,不会有两个条带,但是可能会有一个宽的连在一起的条带。
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问
IP实验阴性对照组IgG有目标条带,但是由于我的蛋白带有V5标签同时曝光V5阴性对照则没有条带,而用目的蛋白的抗体阴性对照有条带
balalaLy
可能是抗体非特异识别IgG,用标签蛋白就好了
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问
为什么会跑出说明书以外的很多杂带
Eason老歌迷
封闭时间不足。或者是你选的抗体特异性不高。
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问
荧光素酶实验用酶标仪测荧光的时候,直接用96孔板上机可以吗?需要特制的板吗?
bamboopiggy
不要用透明的细胞培养板,有那种不透明的黑色或白色的96孔板
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问
蛋白样品在冰箱零下20度最多可以保存多久?
天一湖医者
蛋白样品在冰箱零下20度最多可以保存一个月左右。
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问
新配制的一抗,孵出来蛋白条带只有细细的一条条带,形状像marker一样,不知道什么原因?
whilt-shirt
有可能是你的蛋白浓度太低,建议增加上样量
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问
电转两个半小时之后,分子量大的marker还在胶上,请问这是什么原因?
bamboopiggy
你转膜的条件是多少?反正400mA ,一小时10分钟左右,300kd的蛋白是可以转过去的
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问
酵母双杂交Y2H在四缺培养基上有自激活的话,意味着就是自激活吗?
Eason老歌迷
是的是的。一般检测自激活就是将已知基因构建到可以表达BD结合结构域的载体上,表达形成融合诱饵蛋白(bait),将目标基因构建到可以表达AD激活结构域的载体上,表达形成融合猎物蛋白(prey)。如果诱饵蛋白和猎物蛋白发生互作,BD结合结构域和AD激活结构域在空间上极为接近,GAL4转录因子发生重构,恢复了转录因子的功能,可以激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达与否,从而推测猎物蛋白和诱饵蛋白是
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