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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
WB转膜SIRT1蛋白一直失败的原因?
医往情深丁香园
说明你抗体有问题或者目的蛋白表达量有问题。如果他的也转不过去。
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问
目的蛋白和内参实测分子量都比预期大是什么原因?
一支肾上腺素
因为内参有好几种,分子量差别也比较大,更换分子量与检测蛋白差距更大的内参就可以避免这个问题。
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问
细胞蛋白做WB无趋势的原因?
隔壁家的小夜猫子
点太多了,你想看趋势的时候尽量少点,可以摸索几次,点少了之后内参也可能能更清楚地看出并不齐,可能需要重新normalize
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问
wb一抗和二抗去除液的原理是什么?
小布丁瑶瑶
可以试着用一下膜再生液,等洗好后,再曝光看下还有没有条带,没有就可以孵育新抗体了
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问
分泌性蛋白浓缩后做WB,如何选择内参?
我也是锦鲤ye
内参的选择需要考虑实际的试验环境。
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问
抗体相关问题
一支肾上腺素
一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里, 如双标实验里,如果其中一个一抗是山羊来源的,一个是小鼠来源的,则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗,这时候,二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。
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问
加入loading buffer煮沸后整个变红?
小布丁瑶瑶
可能是蛋白质酸性太强了,可以检测一下样品或ph值
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问
条带出现斑点,内参却很整齐的原因?
红格子一号
封闭可能出了问题或者牛奶没混匀,建议用抗体稀释液
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问
目的蛋白出的来,内参出不来的原因?
是小杨同学
我觉得可能是转膜不均匀,内参没有转上,如果不是转膜的话建议检查一下抗体
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问
测糖基化修饰水平出现两个条带的原因
医往情深丁香园
最好再重复一次实验看看,另外,别人做糖基化跑全膜,主要也是想说明多个糖基化的位点,所以可能出现条带的位置改变,在整张膜上,都可能出条带。
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问
有目的蛋白却没有actin和tublin的原因?
隔壁家的小夜猫子
gapdh这不是挺好的么,你那个基因可能影响贝塔actin表达了,用gap,不放心再用个别的内参试试。
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问
WB转膜中间marker颜色很浅的原因?
我也是锦鲤ye
很可能是转膜没转好,转过了;也可能是没配好。
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问
条带弯曲,中间高两边低的原因?
一支肾上腺素
可能的原因凝胶制备不均匀,中间冷却不好;或者是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,再一个就是可能凝固太快导致聚合不均匀。
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问
如何从一段DNA序列得到翻译的蛋白质,并与已知DNA序列进行比对?
cxsm
你这个应该是想比对测序数据吧,个人认为没有必要换成蛋白序列再去比对。这个可以按照如下流程:1.打开NCBI的网站,一直拉到页面的最下端,在popular纵列里点击blast,2.进去页面点击核酸的blast,3.align two or moresequence勾选上,再将目标序列和模板序列复制进去,点击blast,网页就能显示比对的结果了。
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问
曝光后膜全黑,不知道是什么原因?
此用户已注销
问题已经解决了,是一抗和二抗浓度过高了
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问
免疫共沉淀coip的对照问题
晓柒SQJZ
从您的这个结果来看,蛋白A的检测系统没有work,检查Anti-A抗体的用途,是否是WB,IP通用的抗体,有些抗体只能识别线性表位或只能识别空间表位
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问
免疫共沉淀中珠子预吸附和IgG的问题
丁香实验
你这边所说的非特异性蛋白大致可以理解为能够与protein A琼脂糖珠结合的蛋白;包括能与protein A结合蛋白和与agrose结合的蛋白。这样做毫无疑问会降低非特异结合,但是也要考虑到这一步的局限性:1、是有可能把目的蛋白拉下来的,因为有些蛋白确实会跟proteinA结合,你恰好是做这这样的蛋白就有可能出现这个情况。2、这种方法也没办法把所有非特异结合蛋白去除,所以也不用担心把你的目的蛋白拉
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问
ELISA的样品稀释2000倍,这么大的稀释倍数是否要导致结果不准确?
颜渊溪桥
建议按梯度倍数稀释样品,对照标准曲线,只要不超过标曲范围,检测结果是可信的。
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问
石蜡切片的免疫组化,抗体只标明可做免疫印记,免疫荧光,是否可以做免疫酶技术?
西柚味的芋圆
Elisa应该是不行的,一般做wb的抗体我有尝试去做荧光和组化可以勉强做出来。但是很少很少可以用来做elisa
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问
Elisa中间接elisa和直接elisa到底是靠什么区别的?
西柚味的芋圆
直接法(direct ELISA) 将抗原直接固定在固相载体上,加入酶标记的一级抗体,即可测定抗原总量,此一级抗体的特异性非常重要。 优势:操作手续简短,因无须使用二抗可避免交互反应。 缺点:试验中的一抗都得用酶标记,但不是每种抗体都适合做标记,费用相对提高。 间接法(indirect ELISA) 此测定方法与直接法类似,差别在于一级抗体没有酶标记,改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量
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