2811bp序列pcr扩不出来？

1.重新设计扩增引物，提高引物特异性

2.设计两对引物，进行巢式PCR

关于您提到的2811 bp序列扩增不出的问题，以下是一些建议和方法，您可以尝试调整这些方面以提高扩增效率：

1. 引物设计与优化：检查引物设计，确保引物长度、GC含量、特异性和引物间距离都合适。同时，确保引物没有形成二聚体。可以尝试重新设计引物，或采用软件如Primer3等进行引物优化。

2. 模板量：增加模板DNA的量。较低的模板量可能导致扩增效率降低。尝试增加模板DNA至50-100 ng。

3. PCR反应条件：尝试调整退火温度。虽然已经设置了64℃的退火温度，但2811 bp的序列可能需要更低的退火温度。可以从55℃开始尝试，逐步降低至理想温度。同时，优化循环数、延伸时间以及循环中的退火时间。

4. 聚合酶：更换聚合酶。不同的聚合酶可能对不同序列的扩增效率有所不同，可以尝试使用其他类型的聚合酶，如高保真聚合酶或热稳定性强的聚合酶。

5. Mg2+浓度：调整Mg2+浓度。Mg2+浓度对PCR扩增效率有很大影响。可以尝试从1.5 mM开始，逐步增加至2.5 mM，找到最佳Mg2+浓度。

6. 巢式PCR：如果以上方法均无效，可以尝试进行巢式PCR。通过设计两对引物，分别在两轮PCR中扩增目标序列，可以提高扩增效率。

7. 溶解DNA模板：确保在提取DNA时，模板已经完全溶解。不充分的溶解可能导致扩增效率降低。

尝试以上建议后，若仍然无法成功扩增，可能需要重新考虑提取和纯化DNA的方法，确保提取出高质量的模板DNA。同时，也可以重新设计引物，以获得更好的扩增效率。

如果引物特异性比较高,模板比较纯的话产物也是一样的,如果担心有其他的片段,可以用第一次pcr产物稀释后作为模板继续pcr,这样就能得道比较纯的产物了.

1. 扩增条件非最佳；

2. 样本中含有抑制扩增的物质，如乙醇。

一对引物有其特定的 Tm 值，但 Tm 值时未必是其最佳扩增温度。温度过高时，扩增效率过低，差异部分的目的基因不能被扩增，导致「假阴性」结果的出现。那么，如何确定扩增效率是否满足要求呢？

通常，拿到新引物后应从 Tm- 5℃ 寻找其适宜的扩增温度，在某温度起为特异性扩增。

然后，在特异性扩增的温度下检测扩增效率：将 cDNA 梯度稀释（一般为 2×），测试稀释后的样本 Ct 值差异是否为 1 左右。

1、若差值为 1，则扩增效率良好，可进行正式实验。

2、若在特异性扩增的温度范围内不能使 Ct 值差异为 1，则需考虑重新设计引物