🔥 PCR 纯化回收

PCR 产物可通过硅胶柱纯化回收，硅胶膜在高盐度缓冲液中可以结合 DNA，低盐度缓冲液或水可洗脱 DNA（硅胶膜表面的硅胶醇基团呈弱酸性，水化后带负电荷。当溶液中存在一定浓度的阳离子后，形成的阳离子电子桥能够中和 DNA 和硅烷醇基团之间的表面负电荷，从而使 DNA 牢固的吸附在硅胶膜表面。相反，处于低盐水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅烷醇基团与 DNA 磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放 DNA）。

聚合酶链式反应产物中通常会含有过量的引物、dNTP、酶等，这些会对后续核酸序列测定、酶切、载体构建等产生影响，通过 PCR 纯化回收可获取纯的 DNA 扩增产物。

1.高压灭菌 ddH2O

2.小型离心机

3.水浴锅

4.高压灭菌 Ep 管

5.PCR 产物纯化回收试剂盒

1.在紫外投射仪或凝胶成像仪上，用刀片切取包含目的条带的琼脂糖凝胶并称重；

2.一般以 0.1g 胶加入 100μl 溶胶液的比例（具体根据试剂盒说明添加），按凝胶实际重量加入溶胶液，水浴锅中 55℃ 溶胶（期间可缓慢震动 Ep 管，将胶溶解完全）；

3.回收试剂盒中会配有回收柱和废液管，将溶解好的溶液加入回收柱中，并将回收柱套入 2ml 废液管中；

4. 12000 r/min 离心 30-60s，去除废液；

5.将 500μl 漂洗液加入回收柱，并将回收柱重新套入 2ml 废液管中，12000 r/min 离心 60-90s，去除废液；

6.重复漂洗一次去除废液；

7. 12000 r/min 离心 2min，将回收柱套入高压灭菌后的 1.5ml Ep 管中；

8.向回收柱正中央的滤膜上滴加 20-30μl 洗脱 buffer 或高压灭菌 ddH2O，静置 5-15min；

9. 12000 r/min 离心 90-120s；

10. 将 1.5ml Ep 管中的回收产物再次滴入到回收柱中央的滤膜上，或向滤膜中央再加 10μl 洗脱 buffer 或高压灭菌 ddH2O，继续静置 5-15min；

11. 12000 r/min 离心 120s，1.5ml Ep 管中收集到的溶液即为纯化回收的 PCR 产物。

1. 切取的包含目的条带的琼脂糖凝胶需称重，并按照试剂盒说明要求按比例添加溶胶液；

2. 溶胶需充分；

3. 回收管、ddH2O 要提前高压灭菌；

4. 为尽量提高回收率可以将回收产物再次过柱、离心。

对于后续要进行核酸序列测定或酶切构建的 PCR 产物，最终溶解时需用高压灭菌的 ddH2O，盐离子缓冲液、Tris-HCl 会影响相关实验效率。