【求助】7000bp左右的片段，用PCR的方法怎么样可以获得？

小女子是新手，最近忙于做一个抗病基因的克隆，基因的片段大小7010bp左右，打算采用PCR的方法克隆，Taq LA polymerse和29bp的特异性引物，扩增不出来，请高手指点啊！

扩不出来太正常了。可能你的模板根本就没有，或者降解，或者表达很低。
另一方面，这么长，聚合酶可能在中途就掉下来了。
建议你分段扩增。比如分成5－10个PCR，每段扩600－800bp，设计一些overlap的区域。
最好这些区域中含有唯一的酶切位点，然后通过连接酶把基因连起来。
如果按这种方法，我怀疑在3末端能顺利扩出，可能5末端的就扩不出来了。

哦 谢谢！看过一些文章硕可以P出很长序列的！可是我桌的很艰难，本实验室的一个师兄也曾尝试，不过不了了之了，现在想看看我做的结果再做他的基因。我按你的方法再看看同原序列，考虑一下。非常感谢！

hanrui1009 您好！

不知道您的模板是什么？建议您根据数据库选择表达量高的部位进行模板制备，这样的话，也比较容易扩增出来；

其次，7000bp不好扩增，其实没有必要分成很多段，两三段就可以了，选择合适的酶切位点；

再次，选择高保真的聚合酶，这样扩增出来不容易出现突变，可以适当提高循环数，增大产量，可以设置梯度PCR，寻找最优的条件。

谢谢！你说的很对，值得参考啊！我会再仔细考虑一下的！再次感谢！