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猪卵母细胞的获得

相关实验:猪卵母细胞的获得

最新修订时间:

简介

卵母细胞的体外成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟两方面。细胞核成熟包括:卵母细胞恢复减数分裂,发生 GVBD,排出第一极体,停滞于第二次减数分裂的中期,直到受精(或激活)后才完成第二次减数分裂并排出第二极体。细胞质的成熟包括细胞器的变化和细胞基质的变化。皮质颗粒在胞质合成后,逐渐迁移到质膜下的皮质区。高尔基复合体最初位于核的周围,成熟过程中移向皮质,皮质颗粒完全形成后,高尔基复合体在皮质中消失,发育早期的线粒体为圆形或椭圆形等,主要分布于皮质部,卵母细胞成熟后,线粒体又移向核周围,形成幼稚型线粒体。


随着卵母细胞的成熟,粗面内质网减少,而滑面内质网增多,到成熟晚期,滑面内质网也变得很少,胞质成熟一个非常重要的特点就是积累一些稳定的 mRNA 并在卵母细胞成熟到一定阶段进行蛋白质翻译。在卵母细胞的全面成熟过程中,有很多化学物质参与反应,并在一起相互作用,发生一系列非常复杂的生化事件。因此,卵母细胞在体外成熟时只有具备与体内卵母细胞非常接近的生活环境,才能获得较高的成熟率。

材料与仪器

器材:

① 漏筛

② 注射器

③ 平皿

④ CO2 培养箱

试剂:

① 材料:猪卵巢

② 生理盐水、石蜡

③ TL-HEPES

④ 成熟液

⑤ 透明质酸酶

⑥ 抗生素

步骤

猪卵母细胞获得的基本过程可分为如下几步:

(一)卵巢取送


屠宰场采集的猪卵巢于生理盐水中 1 小时内运回实验室;盐水温度夏季为 32~33 ℃,冬季为 35 ℃。运回实验室后卵巢温度维持 35~36 ℃ 为宜。所用暖瓶应在使用前消毒处理:用热得快烧水煮沸几分钟后,倒掉沸水并另灌加含苯扎溴铵的自来水。

运回的卵巢测温后轻轻地用漏筛沥干血水,后用加有双抗的 37 ℃ 生理盐水边翻边冲洗去血水。

洗净后的卵巢按量分装于 1 或 2 个保温壶中准备开始抽卵。所用漏筛以及暖瓶里外务必刷洗干净去除异味后,于烘箱 37 ℃ 烘干下次备用。

(二)抽卵


使用 10 号针头的 10 ml 注射器,抽取直径 2-8 mm 卵泡中的 COCs,注意针口向下,如抽针的同时抬活塞吸尽卵泡中的卵泡液。抽取的卵泡液置 50 ml 尖底离心管中 37 ℃ 恒温水浴,尽量于 0.5 小时内抽完。

(三)洗卵


抽卵后将离心管置于温箱中,首次沉降 10 分钟,弃上层卵泡液后加入 TL-HEPES 洗涤,摇晃,置温箱沉降 3 分钟,弃上层液体,重复洗涤 2 次,第 3 次加入 TL-HEPES 后倒入国产大平皿中,准备捡卵。

弃上层卵泡液方法:用 10 ml 注射器吸取,较上层时可以快速吸,到接近沉降物时慢速吸,以防止抽到沉降物。

期间准备国产大平皿(底部预先划上间距 1 cm 左右的刻线),并附一国产小平皿,小平皿中添加 TL-HEPES 液。

注:因 TL-HEPES 用量大,洗涤时倒入约离心管 30 ml 处即可。

(四)捡卵


在 1 倍下挑选含有至少 3 层完整卵丘细胞的 COCs,置于上述准备的小平皿中。注意区分死卵、裸卵和形态不规则或胞质不均匀的卵。

口吸管和手吸管的准备:

1. 自来水,加洗涤剂清洗。

2. 放于超声振荡仪中,40 ℃,1 小时。

3. 取出,自来水冲洗 2 次。

4. 放于蒸馏水中,浸泡 1 小时,3 次。

5. 去离子水冲洗 2 次。

6. 干热灭菌箱中,下垫锡箔纸,180 ℃,2 小时。

7. 口吸管用 50 ml 进口离心管装,并用胶带封口。手吸管用锡箔纸包裹。

(五)成熟培养


挑取的 COCs 经 4 滴成熟液洗涤后置于充分平衡(3~4 小时)的 24 孔培养板中培养,每孔加成熟培养液 500 μl,上覆液体石蜡,每孔培养 50 个 COCs 为宜。培养条件为 38.5 ℃,5% CO2,95% 空气,饱和湿度。24 孔板标记:培养时间、卵数、培养者等。

(六)消化


提前 1 小时预热透酶。

培养 42~44 小时后将约 200 枚 COCs 移入一管 700 μl 的 0.1% 透明质酸酶中,振荡涡旋 3 分钟,期间准备两个国产小平皿,加入一多一少操作液,但不少于 2 ml,拉制捡卵针。

涡旋后,先将透明质酸酶移入操作液终止消化,尽快检出卵母细胞置另一含有较多操作液的小平皿中。在显微镜下,以第一极体释放作为卵母细胞成熟的判定标准,挑选成熟卵母细胞并计算成熟率。

完整记录成熟培养的全部情况:卵巢运回时间、卵巢温度、卵巢对数、培养卵数、培养时间、成熟卵数等。

来源:丁香实验

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