载体构建，没扩出来单片段

还有可能是连接失败或者产物降解

1.变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

2.反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95℃ 加热 5~10 分钟。

3.引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

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1酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

2.

模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。

酶的品质（主要是公司的工艺好不好），活性，保质期，buffer的冻融程度都会很大程度影响PCR扩增。因此，换一个酶是相对简单，必须试用的方法。