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科研学霸天团，48小时有问必答

问我想问一下，双CART的构建是构建两种病毒还是构建一个包含两个基因的病毒好？有老师说两个病毒的话会影响转染效率

Eason老歌迷

后一种更好。确实如你老师所言，两个病毒的话会影响转染效率。

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问请问有人在用CAR慢病毒转染Jurkat 细胞吗？为什么转染之后扩增这么难，还死了一大片。

Eason老歌迷

正常，这跟细胞上病毒受体表达的多寡以及细胞的抗病毒能力有关，这两个原因一般无法克服。给提供几个常见的解决方法。一个是加助侵染试剂。二是浓缩病毒，4摄氏度，10K蛋白截留柱离心浓缩，提高病毒滴度后在感染，可以提高感染阳性率。三是分选阳性细胞，一般情况下，慢病毒感染Jurket、THP1这种有免疫能力（指的是分子免疫抗病毒能力）的细胞，基本上不可能做到100%感染，如果你感染以后有分选标签，做一个流式

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问请问做circRNA的大佬大家PCR的时候有p出来好多条条带嘛

Eason老歌迷

出了不少杂带了呗？有很多原因，可能是引物的特异性不高。也可能是酶的用量偏高或酶的质量不好。可能是 Mg2+浓度偏高。或者是反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。也可能是外源DNA污染。

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问DNA纯化

秋秋欣欣

A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min,丢去上清夜，收集菌体。B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积

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问质粒稀释后细胞上样浓度是160Nm,想计算100ml稀释液中需要多少ug干粉？

Eason老歌迷

ug/L和ng/ml其实可等量换算，因为1微克=1000纳克，1升=1000毫升。如果现在的标准单位nmol/L换算成原来的老单位ug/L，应除以3.12，即nmol/L/3.12 =ug/L

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问求助LC/MS检测circRNA翻译产物的问题

天一湖医者

质谱测序不能cover你所有的序列，也就是说你通过它能知道你基因的reading frame没错，但不知道这个蛋白的开始和结尾在哪个点上。我觉得最好的办法用质谱测你完整蛋白的分子量，如果和你的理论值一样，那就是蛋白在胶上的电泳行为的问题，

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问紧急求助大佬

Eason老歌迷

按照你的思路，自杀质粒应该携带目的片段降解了，但是事实是没有降解，那就说明这个降解通路收到抑制或者是压根就是没转染上。

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问上游引物连微球

天一湖医者

这个要看引物长度较短，一般会降低扩增特异性，但会提高有效性，扩增的产物种。

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问包涵体的溶解液，只用脲就可以了吗？有没有更具体的配方？

Eason老歌迷

可以直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。

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问重组质粒双酶切后看不到目的片段，上面那个载体一万多bp，底下这个载体5000多bp，怎么回事？

Eason老歌迷

连接产物酶切后跑胶没见目的片段可能是目的片段量比较少，没有电泳检测不出，挑菌提质粒后有没有目的片段可以用PCR检测一下。

1 回答129 围观

问请问大家，这个质粒图谱的平行箭头表示什么？为什么会有两个平行箭头？为什么箭头有反向？

Eason老歌迷

质粒上有多个基因，基因的方向不一样，所以就有不一样的箭头方向。如果一个图谱上有两个方向，可能是有两个启动子。

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问Southern Blot

Eason老歌迷

背景有点高啊。你可以降低探针的浓度。或者延长封闭时间。或者提高洗膜温度，增加表面活性剂，降低盐浓度。或者用高质量的滤纸接触膜试一试

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问怎么收集细胞上清进行酪蛋白ELISA检测？直接保留上清还是收集细胞后离心保留上清？

balalaLy

直接收集不同时间点的细胞上清，离心去除杂质

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问关于突变信号肽序列研究的相关问题

Eason老歌迷

肯定是不能的。信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电的N末端，称为碱性氨基末端。一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区。一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。一般使用定点突变。

1 回答149 围观

问EMSA求教！！！

天一湖医者

EMSA实验需要设置许多组对照实验。EMSA非放射性探针设计要注意:（1）防止错位配对、封闭成环，排除目标序列以外结合位点的（2）防止产生空间位阻（3）注意AT/GC比例（4）EMSA探针不宜太长，一般是几十碱基对。太长会产生过多结合位点导致结果分析困难，还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。（5）建议采用Biotin或红外荧光标记，尽量不要采用DIG标记。，探针两端都有标记以提高灵敏度

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问Southern Blot

天一湖医者

Southern杂交实验中，基因组酶切后跑电泳用的胶需为9.8cm×8.0cm 大小

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问质粒构建

Eason老歌迷

既然已经换引物了，说明不是引物的事，还是质粒啊，有没有一种可能，发生了自连?

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问紧急求助

天一湖医者

基因和自杀质粒连接不上，一般是因为限制酶的识别位点大多是反向对称的,如果只用用同种酶切,所得片段的2端序列相同,在连接时,是随机连接,不仅会出现反向连接,而且会出现片段串联。

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问细胞技术与形态学板块

balalaLy

伊红很容易染，也很便宜，很可能是你用的伊红有问题，直接换吧

2 回答75 围观

问有没有能够在细胞内产生环状RNA的质粒？

Eason老歌迷

并没有发现。环状RNA由特殊的选择性剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中，具有一定的组织、时序和疾病特异性。

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