做PCR总出现复孔差异大及引物多峰

本人新手一枚，想请教大家：

1、复孔差异大：我做了多次qPCR，PCR反应体系是20ul,CT值基本在32以下，做复孔时大部分情况都会出现较大差异，有时甚至会相差5个CT值，查了一些资料，说是可能与操作和模板质量有关，但我提出的RNA比值基本在2左右，浓度也没有很低。在操作方面，都是cDNA、引物、染料、酶、水分开加，混在一起之后加是不是差异更大？总是出现复孔差异大可能是什么原因呀？

2、引物多峰：不是每次都出现引物多峰，总的做4个基因，每一对引物都出现过多峰，但也不是每个孔都有多峰。引物分装保存，反复冻融不超过8次，会和引物反复冻融有关吗？可能会有什么原因呀？

求指导，十分感谢！