材料与仪器
反转录酶 热稳定 DNA 聚合酶 锚定 3'-寡核苷酸引物 随机 5'-寡核苷酸引物 总 RNA 带放射标记的 dATP
扩增缓冲液 DD-PCR 反转录缓冲液 DTT dNTP 贮存液 胎盘 RNase 抑制剂 测序胶上样缓冲液
琼脂糖凝胶 电解质梯度测序胶 屏蔽型枪头 离心管 正向排液式移液器 PCR 仪 水浴箱
扩增缓冲液 DD-PCR 反转录缓冲液 DTT dNTP 贮存液 胎盘 RNase 抑制剂 测序胶上样缓冲液
琼脂糖凝胶 电解质梯度测序胶 屏蔽型枪头 离心管 正向排液式移液器 PCR 仪 水浴箱
步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
10X 扩增缓冲液
5X DD-PCR 反转录缓冲液（250 mmol/L Tris-Cl（pH 8.3），375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2）
DTT ( 100 mmol/L)
4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)
胎盘 RNase 抑制剂（20 单位/ml）
5X 测序胶上样缓冲液
2. 酶与缓冲液
反转录酶（RNA 依赖的 DNA 聚合酶)
用于 DD-PCR 中的反转录酶是一种 RNaseH 活性缺陷型的酶（如购自 Life Tech-nologies 公司的产品 Superscript 或者购自 Stratagene 公司的产品 StrataScript）。
热稳定 DNA 聚合酶
3. 核酸与寡核苷酸
锚定 3'-寡核苷酸引物（300 μg/ml）溶于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 中，内含有 0.1 mmol/L EDTA
随机 5'-寡核苷酸引物（50 μg/ml）溶于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6）中，内含有 0.1 mmol/L EDTA
总 RNA（100 μg/ml）
4. 凝胶
琼脂糖凝胶
电解质梯度测序胶
5. 放射性物质
带放射标记的 dATP（10 μCi/μl，放射性比活度为 3000 Ci/mmol）
6. 专用设备
自动微量移液器的屏蔽型枪头
离心管（0.5 ml，薄壁扩增反应专用离心管）
正向排液式移液器
PCR 仪
水浴箱水温预设在 65℃ 和 94℃
二、方法
优化 DNA 浓度：cDNA 第一链的制备
1. 用几支 0.5 ml 离心管，设立实验反应管系列，建立对照管和实验管的 RNA 最佳浓度，所谓最佳浓度指后续 DD-PCR 扩增在凝胶电泳和放射自显影上呈现 100~300 条谱带。用水对 RNA 样品进行 5 倍连续稀释系列，产生 RNA 样品浓度范围在 1 μg/ml 与 100 μg/ml 之间系列。
2. 从锚定 3'-寡核苷酸引物库中选择一个或更多的引物，设立不同的稀释 RNA 模板量的复性反应系列：
RNA 模板 8.0 μl
锚定 3'-寡核苷酸引物 2.0 μl
反应管在 65℃ 水浴上温育 10 min，然后放置在 37℃ 水浴上。
复性反应中总 RNA 量应该在 8 ng 至 800 ng 之间变动。
3. 加入如下复性反应试剂：
5X DD-PCR 反转录缓冲液 4 μl
100 mmol/L DDT 2 μl
200 μmol/L 4 种 dNTP 混合液 2 μl
约 25 单位/μl RNase 抑制剂 0.25 μl
200 单位/μl 反转录酶 0.25 μl
H2O 补足至 20 μl
反应管温育样品管在 37℃ 反应 1 h。
4. 将反应管内样品在 94℃ 加热 10 min，使反转录酶失活。
优化 RNA 浓度：双链 cDNA 的扩增与制备
5. 用 8 只 0.5 ml 扩增管设立两个实验系列。每只管应该包含如下试剂：
10X 扩增缓冲液 2 μl
锚定 3' 寡核苷酸引物 2 μl
20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（pH 8.0) 1 μl
[α-33P] dATP 或 [α-35S] dATP ( 3000 Ci/mmol） 1 μl
5 单位/μl 热稳定 DNA 聚合酶 1 单位
H2O 9 μl
对于每支反应管加入 2 μl 5' 随机引物，轻弹管壁使反应液混匀。
6. 从含有测试 RNA 与对照管 RNA 的反转录的两个系列的 8 支试管中各取 3 μl 样品，盖上试管，轻轻混匀样品。
7. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层加一滴矿物油（约 50 μl）。放置离心管在 PCR 仪上。
8. 扩增反应有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：
9. 扩增反应程序运行结束后，从 PCR 仪取出反应管，每只反应管各加入 5 μl 5X 测序胶上样缓冲液。
10. 应用 DNA 序列分析型的电解质梯度聚丙烯酰凝胶电泳分离这种放射标记扩增物电泳在稳压电源作用下进行，到二甲苯腈蓝电泳至凝胶长度的三分之二处结束。抽干凝胶，将凝胶放置在放射自显影底片的下部压片。
11. 检查对照与试验 RNA 的不同浓度来源的扩增反应产物的 DNA 条带谱型。一种理想的差异显示的条带谱型最好能清晰地分辨 100~250 条电泳谱带。DNA 模板的最佳量对于不同的样品、不同的引物也是个不相同的。选择对照与试验 RNA 的最适浓度，使得在该浓度下引物配对引导扩增得到最大量的 DNA 产物。
用于差异显示的扩增 cDNA 的制备
12. 应用所有的引物组合与 RNA 模板最佳量，重新复性，反转录和扩增反应。设计在 PCR 仪上用 96 孔板即微量滴定板设立所有的反应循环。
13. 应用聚丙烯酰胺测序胶电泳分离扩增反应产物，如步骤 9 和 10。用每对引物所获得的扩增反应样品上样在测序凝胶上的毗邻的泳道上，比如应用配对引物 A + B 从一种 RNA 样品所获得的扩增样品与同一对引物 A+B 从另一种 RNA 样品所获得的另一个扩增产物在凝胶泳道上相邻。用这种方法对于样品编排序号后大大简化了对于放射自显影带谱的比较研究。
14. 从不同的 RNA 样品中用每一对引物所获得的扩增产物的带谱的比较研究。
在鉴定不同的表达条带时，通常重复试验确定初始发现的可重复性是极为重要的方法。尽管这种预防措施可能不具有可操作性的，但在理想的情况下，两种 RNA 的不同批次的样品应该被同时应用，便于相互印证。
差异显示的 cDNA 的回收与重扩增
15. 从抽干的聚丙烯酰胺凝胶上回收目的条带。防止放射自显影 X 线片在凝胶的上方，对于放射自显影 X 线片上的目的条带的位置用软铅笔轻划标记。用干净的剃须刀刀刃沿铅笔标记将上层的放射自显影胶片与下层的凝胶一并切割，切下每一条目的条带，将目的条带的凝胶条贴放在 Whatman 3 MM 纸上；将每一薄片的抽干凝胶纸片放入一只 0.5 ml 的离心管（内有 50 μl 灭菌水）。
16. 用小的针穿刺每一只浸泡过夜的 0.5 ml 的离心管的底部；把每一只穿刺管放入一只 1.5 ml 离心管中，离心 20s 后将洗脱液转移至另一只更大的离心管中，丢弃扩增管中残余的凝胶条和 Whatman 3 MM 纸条。
17. 用已洗脱液中的 DNA 片段作模板，在扩增反应管中一次加入如下试剂：
10X 扩增反应缓冲液 2 μl
聚丙烯酰胺凝胶中洗脱的 DNA 样品 3 μl
5'-随机寡核苷酸引物 2 μl
3'-锚定寡核苷酸引物 2 μl
20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（pH 7.0) 1 μl
5 单位/μl Taq 热稳定 DNA 聚合酶 2 单位
H2O 9.5 μl
18. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约 50 μl）。放置离心管在 PCR 以上。
19. 扩增反应有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度如下表：
20. 抽取每种重扩增样品的 5%~10%，用 1% (m/V) 琼脂糖凝胶电泳来估计出重扩增 DNA 片段的含量。
21. 若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层（步骤 18），反应结束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。
22. 将重扩增 DNA 片段连入一种带有 dT 尾的载体（如 Promega 公司出品的 pEGM T 载体），取部分连接液转化大肠杆菌宿主菌。
23. 从培养平皿上挑取 6 个或更多个转化菌落，抽提其质粒 DNA，应用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定，通过比较插入片段的大小确定重组转化子。
24. 应用尽可能多的途径和方法对差异表达的候补的 cDNA/mRNA 分子进行确证，这种确证方法包括 Northern 杂交，RNase 保护或定量 PCR。应用 mRNA 原位杂交技术能够对来自某种疾病或不同发育阶段的组织和差异表达的特异转录产物进行组织定位。
1. 缓冲液与溶液
10X 扩增缓冲液
5X DD-PCR 反转录缓冲液（250 mmol/L Tris-Cl（pH 8.3），375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2）
DTT ( 100 mmol/L)
4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)
胎盘 RNase 抑制剂（20 单位/ml）
5X 测序胶上样缓冲液
2. 酶与缓冲液
反转录酶（RNA 依赖的 DNA 聚合酶)
用于 DD-PCR 中的反转录酶是一种 RNaseH 活性缺陷型的酶（如购自 Life Tech-nologies 公司的产品 Superscript 或者购自 Stratagene 公司的产品 StrataScript）。
热稳定 DNA 聚合酶
3. 核酸与寡核苷酸
锚定 3'-寡核苷酸引物（300 μg/ml）溶于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 中，内含有 0.1 mmol/L EDTA
随机 5'-寡核苷酸引物（50 μg/ml）溶于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6）中，内含有 0.1 mmol/L EDTA
总 RNA（100 μg/ml）
4. 凝胶
琼脂糖凝胶
电解质梯度测序胶
5. 放射性物质
带放射标记的 dATP（10 μCi/μl，放射性比活度为 3000 Ci/mmol）
6. 专用设备
自动微量移液器的屏蔽型枪头
离心管（0.5 ml，薄壁扩增反应专用离心管）
正向排液式移液器
PCR 仪
水浴箱水温预设在 65℃ 和 94℃
二、方法
优化 DNA 浓度：cDNA 第一链的制备
1. 用几支 0.5 ml 离心管，设立实验反应管系列，建立对照管和实验管的 RNA 最佳浓度，所谓最佳浓度指后续 DD-PCR 扩增在凝胶电泳和放射自显影上呈现 100~300 条谱带。用水对 RNA 样品进行 5 倍连续稀释系列，产生 RNA 样品浓度范围在 1 μg/ml 与 100 μg/ml 之间系列。
2. 从锚定 3'-寡核苷酸引物库中选择一个或更多的引物，设立不同的稀释 RNA 模板量的复性反应系列：
RNA 模板 8.0 μl
锚定 3'-寡核苷酸引物 2.0 μl
反应管在 65℃ 水浴上温育 10 min，然后放置在 37℃ 水浴上。
复性反应中总 RNA 量应该在 8 ng 至 800 ng 之间变动。
3. 加入如下复性反应试剂：
5X DD-PCR 反转录缓冲液 4 μl
100 mmol/L DDT 2 μl
200 μmol/L 4 种 dNTP 混合液 2 μl
约 25 单位/μl RNase 抑制剂 0.25 μl
200 单位/μl 反转录酶 0.25 μl
H2O 补足至 20 μl
反应管温育样品管在 37℃ 反应 1 h。
4. 将反应管内样品在 94℃ 加热 10 min，使反转录酶失活。
优化 RNA 浓度：双链 cDNA 的扩增与制备
5. 用 8 只 0.5 ml 扩增管设立两个实验系列。每只管应该包含如下试剂：
10X 扩增缓冲液 2 μl
锚定 3' 寡核苷酸引物 2 μl
20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（pH 8.0) 1 μl
[α-33P] dATP 或 [α-35S] dATP ( 3000 Ci/mmol） 1 μl
5 单位/μl 热稳定 DNA 聚合酶 1 单位
H2O 9 μl
对于每支反应管加入 2 μl 5' 随机引物，轻弹管壁使反应液混匀。
6. 从含有测试 RNA 与对照管 RNA 的反转录的两个系列的 8 支试管中各取 3 μl 样品，盖上试管，轻轻混匀样品。
7. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层加一滴矿物油（约 50 μl）。放置离心管在 PCR 仪上。
8. 扩增反应有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：
9. 扩增反应程序运行结束后，从 PCR 仪取出反应管，每只反应管各加入 5 μl 5X 测序胶上样缓冲液。
10. 应用 DNA 序列分析型的电解质梯度聚丙烯酰凝胶电泳分离这种放射标记扩增物电泳在稳压电源作用下进行，到二甲苯腈蓝电泳至凝胶长度的三分之二处结束。抽干凝胶，将凝胶放置在放射自显影底片的下部压片。
11. 检查对照与试验 RNA 的不同浓度来源的扩增反应产物的 DNA 条带谱型。一种理想的差异显示的条带谱型最好能清晰地分辨 100~250 条电泳谱带。DNA 模板的最佳量对于不同的样品、不同的引物也是个不相同的。选择对照与试验 RNA 的最适浓度，使得在该浓度下引物配对引导扩增得到最大量的 DNA 产物。
用于差异显示的扩增 cDNA 的制备
12. 应用所有的引物组合与 RNA 模板最佳量，重新复性，反转录和扩增反应。设计在 PCR 仪上用 96 孔板即微量滴定板设立所有的反应循环。
13. 应用聚丙烯酰胺测序胶电泳分离扩增反应产物，如步骤 9 和 10。用每对引物所获得的扩增反应样品上样在测序凝胶上的毗邻的泳道上，比如应用配对引物 A + B 从一种 RNA 样品所获得的扩增样品与同一对引物 A+B 从另一种 RNA 样品所获得的另一个扩增产物在凝胶泳道上相邻。用这种方法对于样品编排序号后大大简化了对于放射自显影带谱的比较研究。
14. 从不同的 RNA 样品中用每一对引物所获得的扩增产物的带谱的比较研究。
在鉴定不同的表达条带时，通常重复试验确定初始发现的可重复性是极为重要的方法。尽管这种预防措施可能不具有可操作性的，但在理想的情况下，两种 RNA 的不同批次的样品应该被同时应用，便于相互印证。
差异显示的 cDNA 的回收与重扩增
15. 从抽干的聚丙烯酰胺凝胶上回收目的条带。防止放射自显影 X 线片在凝胶的上方，对于放射自显影 X 线片上的目的条带的位置用软铅笔轻划标记。用干净的剃须刀刀刃沿铅笔标记将上层的放射自显影胶片与下层的凝胶一并切割，切下每一条目的条带，将目的条带的凝胶条贴放在 Whatman 3 MM 纸上；将每一薄片的抽干凝胶纸片放入一只 0.5 ml 的离心管（内有 50 μl 灭菌水）。
16. 用小的针穿刺每一只浸泡过夜的 0.5 ml 的离心管的底部；把每一只穿刺管放入一只 1.5 ml 离心管中，离心 20s 后将洗脱液转移至另一只更大的离心管中，丢弃扩增管中残余的凝胶条和 Whatman 3 MM 纸条。
17. 用已洗脱液中的 DNA 片段作模板，在扩增反应管中一次加入如下试剂：
10X 扩增反应缓冲液 2 μl
聚丙烯酰胺凝胶中洗脱的 DNA 样品 3 μl
5'-随机寡核苷酸引物 2 μl
3'-锚定寡核苷酸引物 2 μl
20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（pH 7.0) 1 μl
5 单位/μl Taq 热稳定 DNA 聚合酶 2 单位
H2O 9.5 μl
18. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约 50 μl）。放置离心管在 PCR 以上。
19. 扩增反应有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度如下表：
20. 抽取每种重扩增样品的 5%~10%，用 1% (m/V) 琼脂糖凝胶电泳来估计出重扩增 DNA 片段的含量。
21. 若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层（步骤 18），反应结束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。
22. 将重扩增 DNA 片段连入一种带有 dT 尾的载体（如 Promega 公司出品的 pEGM T 载体），取部分连接液转化大肠杆菌宿主菌。
23. 从培养平皿上挑取 6 个或更多个转化菌落，抽提其质粒 DNA，应用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定，通过比较插入片段的大小确定重组转化子。
24. 应用尽可能多的途径和方法对差异表达的候补的 cDNA/mRNA 分子进行确证，这种确证方法包括 Northern 杂交，RNase 保护或定量 PCR。应用 mRNA 原位杂交技术能够对来自某种疾病或不同发育阶段的组织和差异表达的特异转录产物进行组织定位。
来源：丁香实验
