差异显示技术(DD-PCR)及其应用

高等植物在其生命活动过程中，由于基因的选择性表达，决定了高等植物生命活动的多样性和连续性。在植物的生长、发育、衰老和死亡过程中，都有不同的基因起作用。因此，研究基因的选择性表达，掌握其对植物生命活动的调控，克隆新基因，是分子生物学的重要课题。

1992年，Liang和Pardee［1］首次提出差异显示技术(DD-PCR)，并且利用这一技术克隆了几个基因。由于该技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRNA的优点［2］，很快成为克隆新基因和研究植物基因表达的有力工具。这项技术最初用于医学研究上，近年来已开始在高等植物研究中应用，为研究高等植物的发育、生理代谢、基因表达提供了重要的技术手段。

1、差异显示技术的原理和实验程序

差异显示的基本原理是，利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。

其技术一般包括下列步骤：

(1)从植物组织中提取总RNA，在这个步骤中注意不能有DNA污染，一般用无RNA酶的DNA酶在37℃下处理30 min；(2)在逆转录酶作用下，以Oligo T11MN 为引物(M为G、A、C中的任一种，N为A、C、G、T任一种)，进行逆转录；(3)PCR反应，扩增cDNA的第一条链；(4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开；(5)找出不同处理间差异显示的条带，从胶上切割下来，并回收，再进行第二次扩增；(6)克隆差异片段，差异片段可作为探针；(7)Northern 杂交，验证目的片段，去掉假阳性片段；(8)对目的片段进行测序；(9)以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。

2、差异显示技术的应用

差异显示技术由于充分利用PCR技术和反转录，因此比较快速，且利用该技术能够观察细胞中mRNA的组成，了解植物不同发育阶段或不同环境条件下的细胞之间的差异表达，克隆目的基因。此项技术常用于下列领域。

2.1 基因表达

Vielle-Calzada［3］和Nuccio利用差异显示技术研究了狼尾草的基因表达情况，发现狼尾草的有性生殖和无融合生殖的子房在基因表达上不同。用2个锚定引物和20个10碱基的随机引物，共显示出2268个cDNA片段。其中有3个基因片段(pcs-2,pca-2,pca-3)能在有性生殖的子房中特异表达，表明无融合生殖子房可能缺少某些基因，而表现无融合生殖。

Brigham等［4］研究碗豆根尖和界面细胞的mRNA和蛋白质的差异表达后指出，两种细胞的mRNA差异与蛋白质差异具有高度的相似性，界面细胞的分化与蛋白表达的变化有关。利用差异显示技术可以揭示植物根的形态建成。Bachem等［5］利用差异显示技术，揭示了马铃薯块茎在不同发育阶段的基因表达情况，并同时比较了马铃薯块茎不同发育时期的mRNA表达情况，认为在块茎形成过程中有2个lox基因，不同时期产生的mRNA数量不同。Opsahl等［6］发现，玉米胚特定区域才能表达的基因——ZmEsr，在开花前4～7d内表达，之后表达量逐渐减少。张立平等［7］比较了水稻对铝敏感品种和抗性品种，在铝胁迫条件下，苗期抗性品种和敏感品种基因表达有明显差异。

2.2 基因的鉴定与克隆

差异显示技术目前已成为鉴定和克隆基因的重要方法。

Hannappel等［8］利用一对近等基因系，研究了西红柿基因组特异区。这对近等基因系中有一个含有抗烟草花叶病毒(TMV)抗性基因Tm-2a，一个不含。这两个近等基因系有一个差异片段，克隆后经Northern杂交证实是阳性克隆，并且发现，这个片段与抗性有密切关系。Joshi［9］利用修饰的差异显示法克隆了小麦HSP70基因族的3个公认的基因，他认为差异显示法在很短时间内就可以克隆基因。Knaap和Kende［10］克隆了水稻的赤霉素调控基因，利用赤霉素处理水稻，一个诱导，一个不诱导，发现二者在差异显示时，mRNA表达量相差10倍，因而很容易克隆了一个赤霉素调控基因。Sharma和Davis［11］利用差异显示法，分析了拟南芥对臭氧的反应。

拟南芥用臭氧处理后，在根和成熟花中，臭氧诱导的转录物AtOZI 1 mRNA含量极高，是叶的3～5倍。序列分析证明，AtOZI 1编码一个Mr8600蛋白多肽，其序列与已知的蛋白序列基本一致，充分表明差异显示方法是克隆基因的有效方法。赵大中等［12］比较春化过和不春化的小麦，发现春化20d的小麦有一个与春化相关的cDNA克隆，经Northern杂交和同源性分析，证明VRC54是春化特异克隆片段，该克隆片段的基因对春化需求型植物的成花诱导起重要作用。

2.3　研究激素对植物发育的影响　

在植物的发育过程中，激素自始至终起着作用，调控着植物的器官形成、生长发育。研究其作用具有重要意义。Peters等［13］发现，用玉米素处理红叶藜的细胞时，mRNA表达量迅速增加，从而使细胞分裂加快。Chen等［14］发现，用赤霉素处理水稻幼苗，然后采用mRNA差异显示技术，处理过的幼苗中mRNA有特异的差异带(UBCgene)。克隆此片段，发现此片段影响基因调控过程中的某些蛋白。瞬时表达分析表明，该序列位于启动子转录起始位点上游231～159碱基位置；另外，还发现UBC gene可促进α-淀粉酶基因表达，从而调节水稻幼苗发育。

2.4　研究植物发育过程　

果实成熟是一个复杂的过程，在这个过程中，基因表达和细胞代谢有一些特殊的变化，其中乙烯对果实成熟有重要影响。为了了解果实成熟的分子机理，Wilkinson等［15］利用差异显示技术分析了果实的发育，发现成熟的草莓与不成熟的草莓之间有较多的差异，有3个特异表达的mRNA片段与果实发育有密切的关系，cDNA片段序列推测的氨基酸序列与已知的蛋白有同源关系。作者认为，差异显示技术能在RNA水平上研究植物果实成熟和其它发育过程。Callard等［16］通过研究拟南芥细胞悬浮培养后期的mRNA差异表达，分析了器官衰老的原因。他们发现，有3个基因(srg1,srg2,srg3)的转录产物mRNA在器官衰老时大量积累，这3个基因转录翻译产生的蛋白酶对衰老器官发育有重要作用。如果改变这3个基因，则有利于延缓器官衰老。Heck等［17］研究了欧洲油菜的胚发育，认为有一个重要的基因Ag115调控胚发育过程。Northern杂交和原位杂交证明，Ag115产生的mRNA和蛋白早在胚的球形期就开始大量积累，随后这些蛋白影响着胚的发育进程。

2.5　研究抗病机制　

植物病害每年都使农作物受到大量损失，因此提高农作物的抗病能力不仅有利于减少损失，而且有利于减少农药使用和环境污染。目前研究植物抗病机理主要方法是探讨植物－微生物的相互作用机制。Benito等［18］通过研究西红柿真菌病害，利用差异显示法对抗病机理进行了探索。他们发现，健康的番茄叶和被真菌或烟草枯斑病毒侵染的番茄叶的mRNA有较大差异。在病菌侵入后，植物防卫基因会迅速产生一系列mRNA，产生蛋白与病原菌相互作用，杀死病原菌或病毒。在相互作用过程中，有3个mRNA片段(ddB-2，ddB-5，ddB-47)大量积累，但相互作用后，则很快消失。这表明，植物的抗病与某些防卫基因的瞬时表达有密切关系。

2.6　研究次生代谢途径　

在植物的生长发育过程中，次生代谢对植物的生长发育有一定的影响，而且许多次生代谢物也是工业急需的。掌握次生代谢的分子机理，将有利于调控次生代谢及次生代谢物的生产。Appleyard和Unkles［19］以稻恶苗病真菌(Gibberella fujikuroi)为实验系统，探讨次生代谢物赤霉酸产生的结果表明，在赤霉酸代谢的各个时期，mRNA表达不一样，其中有16个cDNA片段与赤霉酸合成有关。利用基因诱变方法，进一步确定这16个基因确实决定着赤霉酸的合成。这个实验表明，利用差异显示法可以分离一些编码次生代谢物生物合成途径中酶的基因，用以研究次生代谢的调控。

2.7　研究抗冷机理　

防止冷害是农业生产上的一个重要课题，而弄清作物抗冷机理，有利于提高作物产量。马铃薯是北方寒冷地带重要的作物，了解其抗冷机理，有利于种植和贮藏。Jacobs［20］利用差异显示法分析了马铃薯的抗冷机理。他们把一部分马铃薯进行冷处理，而另一部分不处理，然后比较两者的mRNA表达情况。发现冷处理的马铃薯增加了一些mRNA片段，表明有一些低温诱导的mRNA片段出现，经过Northern杂交分析，这些低温诱导的mRNA片段都是组成性表达。这说明植物本身在遇到低温时，会产生一些应急反应，以抵挡低温危害。

3、差异显示技术使用中存在的问题与解决方法

DD-PCR法有许多优点，已为植物的基因表达研究和基因克隆所证实。但也有一些缺点，如扩增片段短、假阳性高、检测全部mRNA工作量大、基因的克隆受mRNA表达的时效性影响等。而最大的问题还是假阳性太高。据研究，假阳性高达70%［21］，严重地干扰试验结果，使后续工作量极大地增加。所谓假阳性指克隆的DNA片段用Northern杂交时，没有阳性信号。克服假阳性的缺点主要有以下措施。

3.1　改进DD-PCR方法

(1)用无RNA酶的DNA酶处理总RNA，防止DNA污染。
　　(2)使用Tag酶时，批号应相同，不要经常调换。
　　(3)PCR循环次数减至30次，提高退火温度，减少非特异性条带。
　　(4)把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部分，一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆。
　　(5)改变引物长度，如有的在3′端锚定引物和5′端各加上10个碱基，带上EcoRI双酶切位点，如此可显著提高重复性。

 

3.2　改进技术的几种方法

(1)代表性差异分析。此法是由Hubank和Schatz［22］1994年提出的。将合成的cDNA酶切，通过降低cDNA群体复杂度和多次更换cDNA两端接头等方法，特异扩增目的基因片段，重复性好，假阳性低。其主要步骤是，提取总RNA，逆转录合成cDNA，用识别4个碱基的限制性内切酶消化，连接接头，扩增出不同的代表子，进行Tester与Driver杂交，消减杂交富集，从而找出差异cDNA片段。

(2)RC4D法［23］。RC4D法全称为RFLP-domain-directed-differential display，是将RFLP与差异显示技术结合起来的方法，由Fisher首先提出。RC4D法不用10个碱基的随机引物，而是使用一些特异的引物，因而有利于降低假阳性。其具体方法是：首先反转录mRNA，再用一些常用的限制性内切酶酶切，然后连上一些双链接头，用接头引物和FSD(families specific domains)引物进行PCR扩增，产物进行聚丙烯酰胺电泳分离。RC4D方法可大大提高特异性和重复性、分辨率。Fisher用这种方法很快鉴定和克隆了6个MADS-Box gene，经Northern和原位杂交试验证明6个基因无一个假阳性。

(3)cDNA-AFLP法。1996年，Bachem［5］将DD-PCR法与AFLP(amplified fragment length polymorphisms)结合，探索马铃薯块茎发育情况，并克隆了2个cDNA片段(TDF536和TDF531)。cDNA-AFLP法很好地解决了假阳性和重复性等问题。其主要步骤包括：mRNA反转录形成cDNA双链，再用两种限制性内切酶消化，一种是常用内切酶EcoRI，一种是稀有内切酶MseI。然后在消化的cDNA片段上连上接头，再利用与接头相配对的引物进行预扩增。预扩增后，用有2个或3个选择性碱基的引物进行PCR扩增，扩增产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异片段。

3.3　克隆差异片段小的解决方法

差异显示得到的片段较小，不能代表真正差异表达的基因。为了得到全长的基因，传统方法是采用cDNA探针从cDNA文库中筛选，比较复杂。目前人们多采用Lauren等［24］创造的mRNA 5′端逐渐步移技术，以步移法获取的片段大小多在1～1.5kb之间。另外还有一种叫RACE(cDNA末端快速扩增)的方法，也比较快速，简便。

4、结束语

许多年来，人们一直希望改变生物的某些性状，掌握植物的生命活动过程，克隆基因，将一些优良基因导入另一生物中，对植物发育进行调控。差异显示技术的出现，可使人们克隆一些与植物发育有关的基因，通过改变这些基因的结构，重新导入植物体内从而改变其发育进程，如开花时间、次生代谢等。这一技术不仅可以向上游DNA而且可以向下游蛋白质两个方向探讨植物生长、开花、结果的发育过程。当证明某基因与某种生物现象相联系时，就可以利用这种技术研究这些生物过程的调控。

目前利用差异显示技术克隆的大部分片段并没有与生物的功能联系起来，某些克隆片段只是代表了生物信息的某些基因。同时，差异显示技术还有假阳性、检测稀有mRNA困难、不能定量研究等问题尚待解决。但随着差异显示技术的不断改进，它将日益成为科学工作者手中克隆新基因，研究基因表达和植物发育的有效工具。

作者单位：中国农业大学植物科技学院，北京 100094

参考文献

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