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DD-PCR

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6307

实验试剂

 

T12G、T12C、T12A、10-mer的随机引物、RT-PCR试剂盒、测序胶、银染系统

实验设备

 

PCR仪、电泳仪、测序槽、银染设备

实验步骤

 

1. 总RNA提取(略)

2. 残留DNA的去除

反应体系

          1-5ugRNA

          10×DNA酶缓冲液   2ul

          RNA酶抑制剂       1ul

          无RNA酶的DNase   1u

          加DEPC水   至    20ul

混匀,37℃ 15min 等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次,0.3V3M乙酸钠,2V无水乙醇沉淀,冷冻干燥

3. RT    5×RT缓冲液     4ul

         0.2ug总RNA

         10umT12N        1ul

         加DEPC水 至   10ul

     80℃ 1min  42℃ 5min  再加入

         10mMdNTP                2ul

        100mMDTT                 1ul

         50nMMgCl2               1.3ul

         RNA酶抑制剂(40u/ul)     1ul   

         MMLV(200u/ul)           1ul

         加DEPC水至            20ul

        37℃  1小时, 90℃ 1min

4. PCR  上述RT液               4ul

        10×PCR缓冲液          1ul

        25mM MgCl2               1ul           94℃    1min

        10mMdNTP              0.4ul           94℃   30’

        dT12M                 0.2ul           40℃   30’     40循环

        10mer随机引物         0.2ul           72℃   45’

        水                    3.9ul           72℃    6min

        Taq酶(5u/ul)       0.1ul

     混匀后,离心,再加上10ul石蜡油,按右边参数扩增。

5. 检测 龈染检测(略)

6. 差异带切割、回收操作(略)

7.  回收差异带二次扩增

       回收的差异带稀释    50-100倍

        10×PCR缓冲液          1ul

        25mM MgCl2               1ul       94℃    1min    94℃   45’

        10mMdNTP              0.4ul       94℃   45’      42℃   45’

        dT12M                 0.2ul       40℃   45’      72℃   60’

        10mer随机引物         0.2ul      72℃   60’        20循环

        加水至                10ul        20循环        72℃   6min

        Taq酶(5u/ul)       0.1ul

8. PCR片断的再回收和克窿操作(略)

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