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DD-RT-PCR定义是什么?

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1961
传统mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾(polyA)结构,因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征,设计合成了12种下游引物,称3′-锚定引物,其通式为5'-T11MN;同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列,在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带,其中每一条都代表一种特定mRNA种,这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收,扩增至所需含量,进行Southernblot或Northernblot或直接测序,从而对差异条带鉴定分析,以便最终获得差异表达的目的基因。
    虽然mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)具有很多优点:1)速度快,较易操作;2)由于PCR扩增技术的应用,使得低丰度mRNA的鉴定成为可能,且灵敏度高;3)可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。但在实际操作中仍存在一些问题,主要表现在:
1)出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右,重复性差,且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性;
2)在有差异的显示片段中难以知道哪个基因是已经研究过的,哪些是未知基因
3)得到的有差异的扩增条带短,一般在110~450bp之间;
4)以poly(A)为引物的PCR扩增只适合真核生物。
所以差别显示技术自1992年建立后,一直在不断进行着改进。 (责任编辑:大汉昆仑王)
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