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实验问答
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科研学霸天团，48小时有问必答
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双光素酶报告实验 验证靶基因
迟C迟
双荧光素酶报告实验检测灵敏度很跳，酶标仪检测出来的数值就算是重复孔之间差异有时候都是数量级的差别。建议用不一样的实验系统再次验证实验结果。
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问
mRNA药物在早期研发时，做动物/人体实验之前，需要做细胞水平的检测吗？
迟C迟
需要，看下CNS上相关的研究文章你就知道了。
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问
qPCR半定量不稳定？
迟C迟
首先检查自己实验过程、试剂是否正确。其次换个实验系统再次验证自己的想法。如果不一样的实验系统验证出来的结果都是跟你的想法相反，可能要考虑自己的预期结果是否正确了。
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问
为什么格林巴利病人免疫功能有缺陷
whilt-shirt
格林巴利是一急性或亚急性发作慢性损害神经根及中枢神经的脱髓鞘疾病，其病发严重时可侵犯高位脊髓前侧角细胞和脑干神经核以及大脑运动皮质锥体细胞危机生命，属免疫性疾病，大多属病毒感染所致。
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问
之前跑还有条带，重新跑PCR就没条带了，这是什么情况？求解答
刹那芳华2333
检查一下是否是pcr的体系或者反应条件的问题，或者样品存在污染，琼脂糖的浓度或者eb浓度是否有问题
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问
RNA干扰提取RNA注意事项？
迟C迟
① 使用无 RNase 的塑料制品和枪头，玻璃器皿要消毒，避免交叉污染；使用性能较好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；② DEPC 有剧毒，小心配制；配制溶液应使用无 RNase 的水；③ 操作人员应戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套；④ 样品应避免反复冻融，否则影响提取 RNA 提取得率和质量；⑤ 若下游实验对 DNA 非常敏感，可用不含 RNase 的 DNase I
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问
如何确保pbmc人源化小鼠的构建成功率？
whilt-shirt
1、使用正确数量的细胞重度免疫缺陷小鼠（比如NSG™）可以被用于移植人类组织或细胞，这些细胞包括自人源 CD34+ 造血干细胞 (HSC) 或外周血单核细胞 (PBMC)。移植时需要考虑被植入细胞的最佳数量：过多的 CD34+ HSC 可能导致贫血，过多的 PBMC 会加速移植物抗宿主病 (GvHD)。但是，如果移植细胞过少则可能导致移植率过低或移植失败。2、操作太快或太慢需要注意的是，接受细胞移
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问
RNA提取需要注意的事项有哪些？
崔果儿
1.操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩，手套。2.实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。3.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free纪律二:阻止内源酶的活性4.选择合适的匀浆方法。5.选择合适的裂解液。6.控制好样品的起始量。7.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。8.RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不
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问
western blot一定要内参吗？感觉内参变异很大啊
whilt-shirt
内参是需要的，根据不同的组织选择不用的内参。
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问
单细胞rna-seq测序的数据分析流程和bulk的rna-seq一样么。
dxy_gwrp7ndq
bulk的表达矩阵是reads比对到基因的数目；单细胞的表达矩阵是reads比对到某个细胞的某个基因的数目(barcode用来区分细胞；UMI用来区分转录本/基因)
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问
请问单细胞测序技术，用流式细胞术挑选完免疫细胞后，为什么再进行聚类，有的免疫细胞又被划分成其他种类的免疫细胞了。
whilt-shirt
在进行流式细胞术的数据分析时，圈门的方式和逻辑体现了我们对数据把控的准确性，以及对客观数据的理解性。所以建议在数据分析前一定要自己去搞清楚指标和指标的关系，再来按照一定的逻辑进行圈门才会获得比较客观严谨的结果。首先我们要知道，通常展示的结果大部分的时候都只是流式结果的一小部分，比如我们对一个细胞进行双染，流式的结果信息就有4个，即这群细胞双染的双阳群1个，双阴群1个，单阳群2个；那3染呢？即三阳1
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问
如何才能提高上机细胞的活率
府宅
磁珠分选效率会低一点，但细胞活性高。FACS分选的话要加双抗，注意无菌，分选的液体里面可以加血清湿润管子。
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问
胰岛素制备实验中，有什么方法可以有效地去除胰脏周围的脂肪?
迟C迟
首先取材的时候要尽量去除脂肪组织。胰岛素制备过程中，首先准备粗制品：将新鲜或冰冻猪胰（牛胰更好）除去结缔组织等杂质，绞碎成冰胰浆。称重量置提取罐中，加入1．5—2．0倍量的酸性酒精溶液，使PH为2．5—3．0，醇含量为70%左右，在温度为13—150度搅拌提取3h,压滤，使浸液尽量滤出。残渣再用上法提取一次。
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问
对于中药活性成分治疗急性溃疡性结肠炎，FHC细胞模型可以从哪几个方面来做机制呢？
丁香粉猪猪
1，自由基损伤，2，抗炎与免疫，3血液流变学
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问
石蜡切片和冰冻切片的比较？
崔果儿
手术台上当时取的叫（快速）冰冻切片，顾名思义，很快就出结果，医生在台上等候，根据病理科给出的冰冻切片的结果判断良恶性，从而确定切除范围。石蜡切片是术中切除的组织取一小部分，术后送病理科，由病理科在几天内（疑难时间延长）出结果，用于盖棺定论这个组织的良恶性，最为最终诊断。简单说，冰冻迅速而及时，但是有错误的几率，恶性判断为良性等；石蜡稳，病理科说是啥病外科医就认是啥病。
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问
定量分析两个有一定关系的基因
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问
除了使用不含叶酸的培养基外还有没有其他方法避免微量叶酸干扰
whilt-shirt
叶酸含有1个或多个谷氨酰基，天然存在的叶酸大都是多谷氨酸形式。叶酸的生物活性形式为四氢叶酸。叶酸为黄色结晶，微溶于水，但其钠盐极易溶于水。不溶于乙醇。在酸性溶液中易破坏，对热也不稳定，在室温中很易损失，见光极易被破坏。
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问
组织负八十保存后还能进行免疫组化检测吗？实在没有其他样品的情况下，怎么样尽量避免冰晶的影响？
whilt-shirt
可以的，只是组织结构会有些影响，可以考虑采用冰冻切片机切片，然后进行后续的步骤
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问
关于细胞培养怎么选择更合适的培养基？
whilt-shirt
首先看购买细胞公司提供的说明书，如果没有，去各个公司官网查，再不行就各个培养基都试试，先用1640
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问
蛋白质样本提纯方面近年来有什么新的进展？
菲菲飞呀飞
膜分离纯化方法超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。 目前超滤方法研究工作主要集中在膜材料选取方面。潘巧明[4]探讨了大豆蛋白浓缩的工业化生产中，各种条件对聚矾中空纤维膜性能的影响。
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