一、荧光素酶报告基因的检测原理荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。发光机制生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。二、荧光素酶报告基因的检测流程1、重组质粒制备: 制备含有

常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等） 在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。 无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T载就不必考虑了）。先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。 下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。先介绍一下什么是II型内切酶吧。 The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant posit

梅雨季节，听着外面淋淋沥沥的雨声，静静地了解最新学术进展，也是一件舒心的事。 1. Cell：鉴定出肾癌复发新的潜在标志物 肾透明细胞癌是免疫原性肿瘤，复发率为 40%。2021 年 5 月 20 日，来自美国哥伦比亚大学的 Charles G. Drake 教授团队在 Cell 杂志上发表了研究论文 Single-cell protein activity analysis identifies recurrence-associated renal tumor macrophages。该工作发现 TREM2/APOE/C1Q 阳性巨噬细胞浸润是肾透明细胞癌的潜在预后生物标志物，能够作为一个候选治疗靶点。 图 1：来源 Cell 2. Cell Research：揭示代谢物诱导焦亡的新机制 细胞命运与代谢稳态密切相关。 2021 年 5 月 19 日，厦门大学吴乔教授团队在 Cell Research 杂志上发表研究论文 The metabolite α-KG induces GSDMC-dependent pyroptosis through death receptor 6-ac

背景介绍众所周知，几乎所有动物都遵循与日照相关的昼夜节律。自然光的周期变化会带动饮食和睡眠等有「节律」的行为。生物钟使动物体的生理过程与昼夜光周期同步，从而可以预测环境的变化。在哺乳动物中，生物钟是由复杂的转录因子网络，在 24 小时的周期内驱动基因「有节律」的表达而实现的。生物钟几乎存在于机体所有组织中，并通过来自大脑「中央时钟」的神经元和激素信号与实现与环境光周期的同步。肠道中的许多生物过程均表现出由生物钟产生的日常节律效应。然而，肠道的独特之处在于它的许多昼夜节律同样也需要肠道微生物群的参与。例如，微生物群与生物钟协调，在控制脂质代谢的基因表达中产生节律。摄食过程中动物会接触环境中或与食物有关的微生物，因此进食行为也会对食源性病原体产生有「节律」的接触。为了防止感染，哺乳动物肠道上皮会产生先天免疫效应物，包括抗菌蛋白（AMP）。这表明肠道先天免疫同样可能表现出「昼夜节律」特征。尽管近年来相关研究对微生物群-时钟相互作用如何调节代谢的了解越来越多，但我们对这些相互作用如何调节肠道先天免疫知之甚少。在最近一项研究中，来自美国德克萨斯大学西南医学中心的 Lora V. Hooper 课

大脑是神经系统的最高级部分，由左、右两个大脑半球组成，两半球间有横行的神经纤维相联系，结构和功能十分复杂。从大脑这个复杂的系统中获得清晰的、高分辨率的图像信息，同时保持理解系统功能所需的全局视角，是生物学的一项挑战 [1]。近年来，国内外对于脑功能结构的研究日渐增多，脑科学成为研究热点。但由于大脑结构复杂，神经元众多且交联复杂，无法直观明确地看到大脑完整的结构。科学家们要构建单细胞分辨率的脑图集，必须准确识别整个大脑中的细胞 [2]。研究者通过将脑组织染色，显微镜下观察从而得到脑组织中神经元、胶质细胞之间的网络结构图，但脑组织中的脂质、血细胞等成分阻碍了对于神经系统和大脑结构的观察，所以透明化是十分有必要的。但传统的方法，如冷冻切片存在明显的缺点，无法观察连续的 3D 层面上的结构网络，工作量大且破坏神经组织，拍摄成像速度慢，一般至少需要数周，所以需要建立完整的大脑透明技术。BABB, DISCO, CLARITY, PACT/PARS, CUBIC 和 Scale 等在内的有效的组织清除方法的最新发展 [3-8]，可以与光片荧光显微镜结合使用对成年小鼠大脑进行快速高分辨率成像 [9-

导读RAS 是肿瘤患者中最常见的致癌基因之一，目前包括 KRAS、NRAS 以及 HRAS 三种亚型。其中，NRAS 突变多见于黑色素瘤和急性髓系白血病，HRAS 突变多见于膀胱癌和头颈癌，而 KRAS 突变比其他两种更常见，最常发生在肺癌、胰腺癌以及结直肠癌。由于在癌症中的 Ras 蛋白经常发生突变，因此 Ras 突变成为了科学家们着力攻克的热点。RAS 曾被医学界称为「不可成药靶点」，科学家们在研究有效的 RAS 抑制剂方面已经摸索尝试了 30 余年，直至近几年才获得了重大进展。当前已经开发了多种针对 Ras 突变的共价靶向药物，但大多数停滞在临床前阶段，因为这些药物对 Ras 亚型没有选择性，而给身体带来了极大的副作用。因此，亟需开发新的 Ras 的非共价靶向治疗策略。Ras 突变可能导致其异常激活，这种激活过程是通过 Ras 特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子 Sos（Son of sevenless）催化的。Sos 通过特定的结构与野生型和致癌型 Ras 接触，形成非共价结合，以调节下游信号传导。因此，针对 Sos 介导的 Ras 抑制剂的设计将成为癌症干预的有效策略，而纯天然的 R

自身免疫性疾病是免疫系统对自身抗原做出免疫反应从而导致自身组织损伤或功能障碍而引起的一系列疾病。由于自身免疫性疾病的确切发病机制尚不清楚，目前也只是进行早期治疗干预，以防止疾病的发展。来自瑞典卡罗琳斯卡大学医院及研究所妇女儿童健康中心的 Petter Brodin 教授领衔的研究团队在 Cell 发表了题为 Bifidobacteria-mediated immune system imprinting early in life 的研究性论文。研究结果表明：新生儿的肠道菌群会影响其自身免疫系统的发育，而减少全身炎症的关键窗口期就在于出生后的几个月时间里。研究中通过额外补充双歧杆菌，可以协助新生儿消化吸收母乳中的人乳低聚糖（HMO），其代谢产物可以调节免疫细胞的发育。图片来源：Cell背景介绍肠道微生物与人体健康息息相关，肠道微生物对宿主的影响主要与微生物代谢有关，而肠道微生物的组成也会影响其代谢行为。随着年龄的增长，肠道微生物在体内多样性和组成会随之变化，肠道微生物多样性在儿童时期逐渐增加，然后在青春期和成年期达到相对稳定的状态。通常，定植于肠道的微生物主要帮助代谢外源和内源性物质为

导读染色体是细胞生命活动的物质结构基础，与多种细胞过程息息相关，如基因表达、DNA 修复和染色体分离，其正确折叠至关重要。所有细胞都须将自身的基因组通过折叠压缩在一个小体积空间当中。与真核细胞不同，细菌细胞没有核膜，并且不会将其染色体 DNA 包装成类似于核小体的重复结构单元。然而，它们仍然折叠并集中它们的染色体物质，形成一个动态的、有组织的 DNA 网络，称为类核（nucleoid）。近日，美国耶鲁大学 Christine Jacobs-Wagner 研究小组在 Cell 杂志上发表了题为 Interconnecting solvent quality, transcription, and chromosome folding in Escherichia coli 的论文，揭示了大肠杆菌中的染色体折叠规律。图片来源：Cell在本研究中，作者采用细胞的简单聚合物物理学视角，将细胞质视为聚合物溶液，其中聚合物是 DNA，溶剂是细胞质中的其他所有物质（例如，水、代谢物、蛋白质、核糖体和 RNA）。根据聚合物-溶剂相互作用，溶剂的质量大致分为三种类型：理想、良好和差。在良好效应的溶剂中，

不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。没有什么可回报的东西，就发个帖教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNA man等等软件。这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cDNA，就找它的mRNA序列。如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。以cDNA为例，普遍的一种方法是上PUBMED中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但PUBMED导出序列不太方便，我介绍个网站 http://asia.ensembl.org/index.html1. 输入目的基因，进入2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入3. 选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA4. 然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入设置你要显示的内容5. 除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVE CONFI

那么如何通过改变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最佳条件呢？首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用的配方；一种抗体一个脾气。其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子 。。。可是，你有没有考虑过“复方”？--这下配方无限多了吧。1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根据实际情况改变（若出现白板，请降低封闭剂浓度。；黑板多加）。gelatin大家可能比较陌生，不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方，你会发现很多抗体溶液里都有它。2.很多情况下单方的浓度很高了，背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的，比如gelatin＋BSA时，gelatin浓度不能无限提高（会完全竞争掉抗原抗体特异性结合，导致白板），BSA的浓度较随意。3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST，也可用高盐浓度的缓冲液（NaCl 0.5M）以降低背

抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。封闭最短可以缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说实话，经常看到坛子上很多人这样给人答疑，非常的无语）；实际上封闭（极端点）也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。当你的抗体使用次数较多时，基本不用封闭也可以有较低的背景；如果抗体很新，其实封闭最短可以缩减到5min（没试过更短的，不一定不可以）。那什么导致高背景甚至黑板呢？抗体的质量不太好（主因），或者抗体稀释液的配方有问题（增大抗体稀释比略微有所改善）。封闭液的配方可以和抗体稀释液相同，也可以不同；通常封闭液是最简单（单方）的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。封闭很少出状况。不过在milk做封闭剂的封闭液中，milk颗粒未完全溶解时，微小的颗

条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因 敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位

LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。

1. A液（0.2M磷酸二氢钠水溶液）： NaH2 PO4 ・H2 O 27.6g，溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。2. B液（0.2M磷酸氢二钠水溶液）：Na2 HPO4 ・7H2 O 53.6g (或Na2 HPO4 ・12 H2 O 71.6g或Na2 HPO4 ・2 H2 O 35.6g ) 加蒸馏水溶解，加水至1000ml。3. 不同pH值磷酸盐缓冲液（PB）缓冲液的配制A液X ml (参照下表) 中，加入B液Y ml，为0.2M PB。若再加蒸馏水至200ml则成0.1M PB。PHX mlY mlpHX mlY ml5.793.56.56.945.055.05.892.08.07.039.061.05.990.010.07.133.067.06.087.712.37.228.072.06.185.015.07.323.077.06.281.518.57.419.081.06.377.522.57.516.084.06.473.526.57.613.087.06.568.531.57.710.090.06.662.537.57.88.591.56.756.543.57.9

慢性炎症与自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤的发展密切相关，炎性因子白介素 - 17（IL-17）家族在促进宿主防御和自身免疫性疾病中起着重要作用。IL-17 家族由六个成员组成（包括 IL-17A、B、C、D、E、F），IL-17D 是 IL-17 家族中了解最少的成员，其受体也尚不明确。 图片来源：Frontiers in Immunology(1)2021 年 4 月 13 日，清华大学医学院董晨院士团队在 Immunity 上在线发表了题为 Interleukin-17D regulates group 3 innate lymphoid cell function through its receptor CD93 的研究成果 (2)。 该研究发现肠上皮细胞来源的 IL-17D 通过与其受体 CD93 结合，在调节三型固有淋巴样细胞（ILC3s）功能并维持肠道稳态中发挥关键作用。 图片来源：Immunity研究内容「我是谁」IL-17D 有什么生理功能？为了了解 IL-17D 的生理功能，作者首先检测了 IL-17D 在小鼠组织中的表达情况，结果发现 IL17D 在小鼠的结肠和

自山中伸弥获得 2012 年诺贝尔医学奖以来，人们对干细胞在再生医学中的应用寄予厚望。可 9 年过去了，iPSC 的出现依旧未能解决干细胞研究领域最大的问题：如何获得大量的人类全能干细胞？ 胚胎干细胞，作为另外一种全能干细胞的来源，由于伦理学原因同样进展缓慢。但为了规避这个问题，一些科学家「另辟蹊径」打起来了跨物种嵌合体的主意。 图片来源：Cell 2021 年 4 月 16 号，来自我国昆明理工大学的季维智院士、谭韬教授、牛昱宇教授携手索尔克生物研究所的 Juan Carlos Izpisua Belmonte，在 Cell 上刊登了题为 Chimeric contribution of human extended pluripotent stem cells to monkey embryos ex vivo 的研究 [1]， 报道了人类首次在体外制造出了人猴嵌合胚胎，为体外大量制备人类多能干细胞提供了新的可能。 研究内容： 得益于昆明理工大学季维智院士团队所开发出的，能够使得猕猴胚胎在体外「超长待机」的新技术，Juan Carlos 教授团队与北京大学邓宏魁教授团队此前得到的人

春暖花开，波光粼粼。实验之余，靠着绿树阅读文献、了解最新研究进展也是一件惬意的事。本周学术君继续带你遨游科研之海吧！1. Nature: 解密太平洋地区的人类血统 太平洋地区包括近大洋洲和远大洋洲，人类约在 4.5 万年前在近大洋洲定居。 2021 年 4 月 14 日，法国巴斯德研究所 Lluis Quintana-Murci 教授团队在 Nature 杂志上发表研究论文 Genomic insights into population history and biological adaptation in Oceania。 该研究详细地分析了太平洋地区的人群历史，阐释了人类演化、古人类种群间的基因交流和古人类对岛屿环境的适应性。 该工作揭开了太平洋地区人类血统的神秘面纱，对于人类厘清自身规律具有重要的指导意义！ 图 1：来源 Nature 2. Nature Metabolism: 为什么有的人总是容易饿、吃得多 目前，肥胖影响着全世界 38% 的成年人、16% 的儿童和青少年的健康。 2021 年 4 月 12 日，在 Nature Metabolism 杂志上发表研究论文 P

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，受到细胞内外信号交互作用的精密调控。D 型细胞周期蛋白 (cyclin D1, D2 和 D3) 与细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）是整个细胞周期调控机制中的核心分子，驱动细胞增殖。细胞周期失调是人类癌症的一个共同特征，其中 cyclin D-CDK4/6 复合物的水平和活性与不受约束的细胞增殖密切相关。自从 20 世纪 90 年代发现 cyclin D 以来，人们就对其进行了深入研究，但是关于 cyclin D 的降解机制和调控机制尚不完全清楚。 2021 年 4 月 15 日，Nature 三连发表重磅论文为长期探索的科研难题，D 型细胞周期蛋白如何正常降解，提供了答案。同时 Nature 还在线发表题为 Path to destruction for a cell-division regulator 的 News & Views，高度评价了三个团队从不同的角度切入，完善了周期蛋白调控和降解机制，提高了我们对整个细胞周期进程的理解。图片来源：Nature Simoneschi，Chaik

背景介绍多项研究结果均表明，睡眠不足与心血管 (CV) 疾病和全因死亡相关，这也是普通大众对睡眠的基本认知。此外，睡眠时间与全因死亡率和 CV 死亡率之间呈 U 型关联，过短 (<6 小时 / 天) 和过长 (>8 小时 / 天) 都是不利于健康的，可见并不是睡得越多越好。事实上，睡眠长度本身并不能反映关键的神经生理学方面，睡得长并不代表睡眠质量高，也不代表有着良好的睡眠连续性和睡眠深度。前期的研究结果也显示，睡眠不规律、入睡困难等均与死亡风险增加有关，而与睡眠时间长短无关。先前的研究尽管表明了睡眠时间过短或过长都与死于心血管疾病或其他原因的风险增加有关。然而，直到现在，人们还不知道在夜间睡眠中唤醒负担 (唤醒次数和持续时间的组合) 是否也与死亡风险有关，唤醒负担 (AB) 在心血管相关疾病和全因死亡率的详细临床意义仍然未知。 2021 年 4 月 20 日，来自澳大利亚阿德莱德大学电气和电子工程学院等单位的研究团队在 European Heart Journal (IF = 22.67) 在线发表了题为 Sleep arousal burden is associated

人体所需的 9 种必需氨基酸中，有 3 种被称为支链氨基酸 （BCAA，Branched Chain Amino Acid）： 亮氨酸（Leucine）、异亮氨酸（Isoleucine）、缬氨酸（Valine）。BCAA 也是健身补剂市场上历史最悠久、据说最有效的产品之一。随着「健康」的重要性被越来越多的人认识，大量健康的饮食方式层出不穷。「地中海饮食」、「生酮饮食」、「低碳水饮食」等各种饮食方式也进入了大众的视线。不少饮食方式也推荐大家摄入更多的蛋白质，来取代碳水与脂肪。然而，这些做法真的是百利而无一害吗？学术界其实并未给出明确的答案。图片来源：Cell Metabolism 2021 年 4 月 22 号，Cell 子刊 Cell Metabolism 在线刊登了由威斯康星大学的喻德阳博士作为第一作者，其导师 Dudley W. Lamming 担任通讯作者的论文 [1]，题为 The adverse metabolic effects of branched-chain amino acids are mediated by isoleucine and valine。该研究发现