PNAS：RAS 抑制剂又添一员，新型蛋白模拟物或为癌症治疗

丁香学术2021-09-08

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导读

RAS 是肿瘤患者中最常见的致癌基因之一，目前包括 KRAS、NRAS 以及 HRAS 三种亚型。其中，NRAS 突变多见于黑色素瘤和急性髓系白血病，HRAS 突变多见于膀胱癌和头颈癌，而 KRAS 突变比其他两种更常见，最常发生在肺癌、胰腺癌以及结直肠癌。由于在癌症中的 Ras 蛋白经常发生突变，因此 Ras 突变成为了科学家们着力攻克的热点。

RAS 曾被医学界称为「不可成药靶点」，科学家们在研究有效的 RAS 抑制剂方面已经摸索尝试了 30 余年，直至近几年才获得了重大进展。

当前已经开发了多种针对 Ras 突变的共价靶向药物，但大多数停滞在临床前阶段，因为这些药物对 Ras 亚型没有选择性，而给身体带来了极大的副作用。因此，亟需开发新的 Ras 的非共价靶向治疗策略。

Ras 突变可能导致其异常激活，这种激活过程是通过 Ras 特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子 Sos（Son of sevenless）催化的。Sos 通过特定的结构与野生型和致癌型 Ras 接触，形成非共价结合，以调节下游信号传导。因此，针对 Sos 介导的 Ras 抑制剂的设计将成为癌症干预的有效策略，而纯天然的 Ras-Sos 复合体结构为合理设计稳定的 Ras 抑制剂提供了依据。

来自纽约大学的 Paramjit S. Arora 团队在 PNAS 在线发表了题为 A Sos proteomimetic as a pan-Ras inhibitor [1] 的文章。该研究开发了一种结构稳定的 Sos 蛋白模拟物，可与野生型和致癌型 Ras 非共价结合，并调节下游激酶信号。该模拟物能够抵抗蛋白水解并进入癌细胞，对巨胞饮作用上调的癌细胞具有选择性毒性，包括那些具有致癌 Ras 突变的细胞，为开发 Ras 突变型癌症非共价靶向抑制剂提供了理论基础。

图片来源：PNAS

研究内容

Sos 三级螺旋模拟的设计

Sos 单螺旋二级结构模拟物可与 Ras 结合，但其对 Ras 的选择性结合不如三级结构强，会引起副作用。研究团队便试图开发一种包含双螺旋的 Sos 三级结构模拟物。

首先，研究团队借助计算机服务器和嵌合体可视化软件设计了一系列 Sos 三级螺旋模拟，在不断改进自身稳定性以及与 Ras 的结合亲和力的过程中，CHD^Sos-5 诞生了。

图片来源：PNAS

Sos 蛋白模拟物 CHD^Sos-5 在构象和蛋白水解上稳定，并在其开关区域结合 Ras

构像稳定是肽发挥作用的前提。研究团队通过圆二色谱法（CD）实验发现 CHD^Sos-5 具有明确的螺旋特征。酶促蛋白水解是限制肽治疗潜力的关键因素。研究团队分析了 CHD^Sos-5 在血清中的蛋白水解稳定性，发现 CHD^Sos-5 不会轻易被蛋白水解酶水解。

为了确定蛋白质模拟物是否与 Ras 结合在 Sos 结合区，研究团队进行了核磁共振（NMR）异核单量子相干（HSQC）实验，该实验监测特定蛋白质残基在配体结合或构象改变时的化学位移变化，与化学交联结果一致证明了 CHD^Sos-5 结合到了 Ras 的 Sos 结合位点。

图片来源：PNAS

Ras 突变调控细胞对 Sos 蛋白模拟物的摄取和作用

Sos 蛋白模拟物对细胞发挥调节作用需要进入细胞内部。活细胞荧光显微镜和流式细胞术显示，Ras 突变的膀胱和肺癌细胞中，细胞显著摄取荧光素标记的 CHD^Sos-5 进入胞浆。Ras 突变的癌细胞对 CHD^Sos-5 的摄取增强表明 Sos 蛋白类似物可能对这些细胞有选择性的毒性。

基于这一前提，研究团队探索了 CHD^Sos-5 与 H-Ras 突变型结合的可能性。野生型和 G12X 突变体 H-Ras 与 CHD^Sos-5 的肽滴定实验表明，蛋白模拟物在类似的低微摩尔亲和力范围内结合所有 Ras 蛋白。

随后研究团队评估了 Sos 蛋白模拟物抑制细胞中 Ras 信号转导的潜力。MTT 细胞活性实验发现，与野生型细胞系相比，CHD^Sos-5 对含有致癌 Ras 突变的细胞系表现出浓度依赖性毒性，并且细胞活性与不同细胞系间固有的巨胞饮摄取水平呈负相关。这些结果表明，利用上调的巨胞饮作用为突变癌细胞提供治疗提供了潜在优势。

图片来源：PNAS

化学蛋白质组学分析揭示了 CHD^Sos-5 的细胞靶点

Ras 蛋白由 150 多个成员组成，包括 Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran 亚家族。预计 Ras-Sos 复合物可能有多种组合模式，比如 Rab-Sos、Ran-Sos、Ras、Sos 等，目前尚无法知道 Sos 可能与哪些 Ras 家族成员结合。为了确定 CHD^Sos-5 的结合部位，研究团队对 H358 肺癌细胞进行荧光标记，然后通过基于蛋白质组学方法来富集相互作用因子及特征。

研究团队共鉴定出 143 个蛋白质靶点：K-Ras、Ran 和几种 Ras 相关蛋白（RAB13、RAB10、RAB14、RAB18、RAB5C 和 RAP1B）。序列分析表明，在 Sos 螺旋发夹结合区富集的 Ras 相关蛋白和其他 G 蛋白之间存在高度的序列相似性。

图片来源：PNAS

总的来说，该研究开发了一种 Sos 蛋白模拟物，它结合野生型和突变型 Ras，并对致癌 Ras 细胞具有选择性毒性作用。这种模拟物将为开发高 Ras 突变型癌症靶向抑制剂提供坚实的理论依据。

延伸阅读

该研究是同一团队十年前报道的跟进研究。

图片来源：ScienceDirect 截图

2011 年，Paramjit S Arora 团队在 Nature Chemical Biology 上发表了题为 An orthosteric inhibitor of the Ras-Sos interaction 的论文 [2]，首次开发了基于鸟嘌呤核苷酸交换因子 Sos 的单 α-螺旋模拟物，这是一种蛋白质二级结构模拟物，作者证明了该模拟物可干扰 Ras-Sos 相互作用并下调 Ras 信号。

然而，这种二级结构模拟物存在一定局限性，它更倾向于共价结合 Ras，这种结合方式对 Ras 亚型没有选择性，具有极大的副作用。

图片来源：Nature Chemical Biology

本次新研究，在原来研究的基础上，将 Sos 模拟物改造成双螺旋，从原来的二级结构改进成了三级结构。这种结构的 Sos 模拟物构象稳定，可与野生型和致癌型 Ras，并调节下游激酶信号，对巨胞饮作用上调的癌症有选择性毒性作用，为开发 Ras 突变型癌症靶向抑制剂提供了理论基础。

参考文献：

[1] Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 May 4;118(18):e2101027118.

[2] Nat Chem Biol. 2011 Jul 17;7(9):585-7. doi: 10.1038/nchembio.612.