原理
观察阿霉素（Doxorubicin，DOX）单用或与RAPA联合用药对HepG2和Hep3B细胞生物学行为及PI3K/Akt/mTOR信号通路活性的影响，探讨mTOR抑制剂增强HCC化疗药物疗效的相关作用机制。
材料与仪器
HepG2细胞 Hep3B细胞
阿霉素 RAPA
培养箱 荧光显微镜 流式细胞仪 二氧化碳细胞培养箱 酶标仪 盖玻片 载玻片
阿霉素 RAPA
培养箱 荧光显微镜 流式细胞仪 二氧化碳细胞培养箱 酶标仪 盖玻片 载玻片
步骤
一、细胞表达检测
1. 分别取对数生长期的HepG2和Hep3B细胞，以不同浓度的DOX单用或与RAPA（20 nmol/ml）联合应用培养48 h或24h。
2. 以MTT法测定药物对HepG2和Hep3B细胞的增殖抑制作用，以流式细胞技术检测二者的凋亡情况，以 Western blot法检测者P-p70S6K（T389）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）的表达改变。
1. 分别取对数生长期的HepG2和Hep3B细胞，以不同浓度的DOX单用或与RAPA（20 nmol/ml）联合应用培养48 h或24h。
2. 以MTT法测定药物对HepG2和Hep3B细胞的增殖抑制作用，以流式细胞技术检测二者的凋亡情况，以 Western blot法检测者P-p70S6K（T389）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）的表达改变。
二、细胞表达结果
1. 0.156～2.5 mg/L浓度范围内，DOX能抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖，且呈浓度依赖性；DOX在0.625～10mg/L浓度范围内，Hep3B细胞的相对存活率显著大于HepG2细胞（P<0.01）。
2. 与DOX单用比较，DOX（0.156～2.5 mg/L）与RAPA联用显著降低了HepG2和 Hep3B细胞的存活率（P<0.01或P<0.05），DOX（0.156～10mg/L）与RAPA联用，Hep3B细胞存活率显著大于 HepG2细胞（P<0.01）。
3. DOX（0.156～10 mg/L）单用或与RAPA联用24h均可诱导HepG2和Hep3B细胞凋亡发生，且 随DOX浓度增加，凋亡牢升高。
4. 与DOX单用比较，DOX（1.25～10 mg/L）与RAPA联用，HepG2细胞捌亡率较显著升高 （P<0.01或P<0.05），DOX（2.5～10 mg/L）与RAPA联用，Hep3B细胞凋亡率显著升高（分别P<0.05）。
5. DOX（5.0～10mg/L）单用，HepG2细胞凋亡率显著大 于Hep3B细胞（分别P<0.05），DOX（2.5～10 mg/L）与RAPA联用，HepG2细胞凋亡率显著大于Hep3B细胞（分别P<0.01）。
6. RAPA（20nmol/L）、DOX（2.5mg /L）以及二者联用均可导致HepG2或Hep3B细胞P-p70S6K（T389）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）表达减 少，且以DOX与RAPA联用效应最为明显。
1. 0.156～2.5 mg/L浓度范围内，DOX能抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖，且呈浓度依赖性；DOX在0.625～10mg/L浓度范围内，Hep3B细胞的相对存活率显著大于HepG2细胞（P<0.01）。
2. 与DOX单用比较，DOX（0.156～2.5 mg/L）与RAPA联用显著降低了HepG2和 Hep3B细胞的存活率（P<0.01或P<0.05），DOX（0.156～10mg/L）与RAPA联用，Hep3B细胞存活率显著大于 HepG2细胞（P<0.01）。
3. DOX（0.156～10 mg/L）单用或与RAPA联用24h均可诱导HepG2和Hep3B细胞凋亡发生，且 随DOX浓度增加，凋亡牢升高。
4. 与DOX单用比较，DOX（1.25～10 mg/L）与RAPA联用，HepG2细胞捌亡率较显著升高 （P<0.01或P<0.05），DOX（2.5～10 mg/L）与RAPA联用，Hep3B细胞凋亡率显著升高（分别P<0.05）。
5. DOX（5.0～10mg/L）单用，HepG2细胞凋亡率显著大 于Hep3B细胞（分别P<0.05），DOX（2.5～10 mg/L）与RAPA联用，HepG2细胞凋亡率显著大于Hep3B细胞（分别P<0.01）。
6. RAPA（20nmol/L）、DOX（2.5mg /L）以及二者联用均可导致HepG2或Hep3B细胞P-p70S6K（T389）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）表达减 少，且以DOX与RAPA联用效应最为明显。
三、细胞表达结果分析
1. DOX可抑制HepG2和Hep3B细胞生长增殖，促进细胞凋亡，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度。
2. DOX与 RAPA联合用药能显著抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖，促进细胞凋亡，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度，并在一定浓度范围内表 现出协同效应。
3. 在一定浓度范围内，HepG2细胞对DOX单用或与RAPA联合用药的敏感性显著高于Hep3B细胞，可能与HCC细胞p53的表达 差异有关。
1. DOX可抑制HepG2和Hep3B细胞生长增殖，促进细胞凋亡，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度。
2. DOX与 RAPA联合用药能显著抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖，促进细胞凋亡，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度，并在一定浓度范围内表 现出协同效应。
3. 在一定浓度范围内，HepG2细胞对DOX单用或与RAPA联合用药的敏感性显著高于Hep3B细胞，可能与HCC细胞p53的表达 差异有关。
来源：丁香实验
