【求助】请教caspase抑制剂为何出现反作用？
丁香园论坛
1405
各位老师好，我的实验出现了问题，很急，想向各位请教，希望能获得帮助。
我的实验设计是看药物A能否增加细胞对TRAIL因子敏感性、促进细胞凋亡，因此我将低浓度的药物A（MTT致死率为10%左右）与TRAIL一起作用细胞，因为TRAIL引发的凋亡通路要通过caspase的激活而实现，因此我同时再另外设置添加caspase抑制剂的实验组，即A + TRAIL + caspase抑制剂。观察到的实验现象很奇怪，A + TRAIL出现了协同作用，细胞死亡数量上升，但是额外加入caspase抑制剂的确不但无法阻止凋亡，还促进细胞凋亡。
请问是否是我加caspase抑制的方式或浓度不对，我采用20uM，加药前1h加入caspase抑制剂？我的caspase是用DMSO溶解的，做实验时我也设置莪加DMSO的空白对照，细胞是还好的，因此我想不是DMSO造成的细胞毒。
不知各位能否给我一些指导，很感谢！！！
我的实验设计是看药物A能否增加细胞对TRAIL因子敏感性、促进细胞凋亡，因此我将低浓度的药物A（MTT致死率为10%左右）与TRAIL一起作用细胞，因为TRAIL引发的凋亡通路要通过caspase的激活而实现，因此我同时再另外设置添加caspase抑制剂的实验组，即A + TRAIL + caspase抑制剂。观察到的实验现象很奇怪，A + TRAIL出现了协同作用，细胞死亡数量上升，但是额外加入caspase抑制剂的确不但无法阻止凋亡，还促进细胞凋亡。
请问是否是我加caspase抑制的方式或浓度不对，我采用20uM，加药前1h加入caspase抑制剂？我的caspase是用DMSO溶解的，做实验时我也设置莪加DMSO的空白对照，细胞是还好的，因此我想不是DMSO造成的细胞毒。
不知各位能否给我一些指导，很感谢！！！
有如下情况需要考虑：
1、即便有对照，加入DMSO的最终浓度也要≤0.1%
2、注意caspase抑制剂要一直存在，并非只存在1个小时。
3、加药过程动作要快且轻柔，避免干板或造成过度的机械性损伤。
4、估计你用的是Z-VAD-fmk，你的细胞系的应用浓度需要有文献支持，我个人认为你的浓度似乎高了。
5、需要重复：确定凋亡检测方法选择正确，重复性好，结果方能可信。
祝顺利！
1、即便有对照，加入DMSO的最终浓度也要≤0.1%
2、注意caspase抑制剂要一直存在，并非只存在1个小时。
3、加药过程动作要快且轻柔，避免干板或造成过度的机械性损伤。
4、估计你用的是Z-VAD-fmk，你的细胞系的应用浓度需要有文献支持，我个人认为你的浓度似乎高了。
5、需要重复：确定凋亡检测方法选择正确，重复性好，结果方能可信。
祝顺利！
如果你是用96孔板做的MTT，不知道你的药物是如何加入的？是把重复孔的药物混合均匀后再加入还是每孔加药？最好先混合均匀后再加入细胞。
2 你没有做caspase inhibitor单独作用时对细胞是否有毒性？你的caspase inhibitor的浓度是否参考文献，与你的细胞株是否一致？浓度太高会有非特异作用。
3 你的A药是DMSO溶的吗？如果加入三种药，你能保证三种药的DMSO的量与你用DMSO的溶剂对照的浓度是一样吗？
如果你排除了以上的问题，应该可以找到答案的。
2 你没有做caspase inhibitor单独作用时对细胞是否有毒性？你的caspase inhibitor的浓度是否参考文献，与你的细胞株是否一致？浓度太高会有非特异作用。
3 你的A药是DMSO溶的吗？如果加入三种药，你能保证三种药的DMSO的量与你用DMSO的溶剂对照的浓度是一样吗？
如果你排除了以上的问题，应该可以找到答案的。
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
