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【求助】请教caspase抑制剂为何出现反作用?

丁香园论坛

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各位老师好,我的实验出现了问题,很急,想向各位请教,希望能获得帮助。
我的实验设计是看药物A能否增加细胞对TRAIL因子敏感性、促进细胞凋亡,因此我将低浓度的药物A(MTT致死率为10%左右)与TRAIL一起作用细胞,因为TRAIL引发的凋亡通路要通过caspase的激活而实现,因此我同时再另外设置添加caspase抑制剂的实验组,即A + TRAIL + caspase抑制剂。观察到的实验现象很奇怪,A + TRAIL出现了协同作用,细胞死亡数量上升,但是额外加入caspase抑制剂的确不但无法阻止凋亡,还促进细胞凋亡。
请问是否是我加caspase抑制的方式或浓度不对,我采用20uM,加药前1h加入caspase抑制剂?我的caspase是用DMSO溶解的,做实验时我也设置莪加DMSO的空白对照,细胞是还好的,因此我想不是DMSO造成的细胞毒。
不知各位能否给我一些指导,很感谢!!!
有如下情况需要考虑:
1、即便有对照,加入DMSO的最终浓度也要≤0.1%
2、注意caspase抑制剂要一直存在,并非只存在1个小时。
3、加药过程动作要快且轻柔,避免干板或造成过度的机械性损伤。
4、估计你用的是Z-VAD-fmk,你的细胞系的应用浓度需要有文献支持,我个人认为你的浓度似乎高了。
5、需要重复:确定凋亡检测方法选择正确,重复性好,结果方能可信。

祝顺利!
如果你是用96孔板做的MTT,不知道你的药物是如何加入的?是把重复孔的药物混合均匀后再加入还是每孔加药?最好先混合均匀后再加入细胞。
2 你没有做caspase inhibitor单独作用时对细胞是否有毒性?你的caspase inhibitor的浓度是否参考文献,与你的细胞株是否一致?浓度太高会有非特异作用。
3 你的A药是DMSO溶的吗?如果加入三种药,你能保证三种药的DMSO的量与你用DMSO的溶剂对照的浓度是一样吗?

如果你排除了以上的问题,应该可以找到答案的。

本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

师兄微信号:shixiongcoming

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