【求助】信号通路抑制剂的配制和使用请教
丁香园论坛
12076
我刚买了几个信号通路的特异性抑制剂，分别是NF-кB(PDTC)、PI3K/Akt (LY294002）、 p38 MAPK (SB203580) ；
看说明书，PDTC的分子量是164.29，PDTC可溶于水(1mg/ml)，在DMSO中的溶解度可达到100mM； LY294002 的分子量是307.3，1mg用DMSO配制，浓度为10mg/ml，共0.1ml ；SB203580 的分子量是377.43，1mg用DMSO配制，浓度为20mg/ml，共50μl。
现在的问题是 不知道怎么把他们配成我需要的工作浓度(均是10uM)。不太会换算，呵呵。
还有文献中浓度单位均写成uM，那这个是uM/L还是uM/mL？
另外加了抑制剂预处理1h后，再加我的刺激因子，那这之前需要用PBS什么的洗掉吗？还是1h后直接加因子刺激？
请做过抑制剂的战友多多指教！
看说明书，PDTC的分子量是164.29，PDTC可溶于水(1mg/ml)，在DMSO中的溶解度可达到100mM； LY294002 的分子量是307.3，1mg用DMSO配制，浓度为10mg/ml，共0.1ml ；SB203580 的分子量是377.43，1mg用DMSO配制，浓度为20mg/ml，共50μl。
现在的问题是 不知道怎么把他们配成我需要的工作浓度(均是10uM)。不太会换算，呵呵。
还有文献中浓度单位均写成uM，那这个是uM/L还是uM/mL？
另外加了抑制剂预处理1h后，再加我的刺激因子，那这之前需要用PBS什么的洗掉吗？还是1h后直接加因子刺激？
请做过抑制剂的战友多多指教！
还有就是配制抑制剂时需要过滤除菌吗？或者其他方法消毒？毕竟是作用于细胞的。
uM 是指微摩尔每升吧。先算下你打算配成多少摩尔浓度的，一般10um工作液的话可以先配成10mM或者1mM的母液，再算稀释多少倍到工作浓度
一般高浓度母液也有利于保存。DEMO稀释后保证体积比小1%，不会对细胞造成毒性就可，当然需要加一个溶媒对照组。
DMSO不需要过滤除菌，如果你试验只观察24小时左右更不需要了
加抑制剂后加刺激因子，有的是更换掉，需要洗，有的是抑制剂刺激剂加在一起，不需要洗，看你试验的目的需要的。再仔细看看相关文献
一般高浓度母液也有利于保存。DEMO稀释后保证体积比小1%，不会对细胞造成毒性就可，当然需要加一个溶媒对照组。
DMSO不需要过滤除菌，如果你试验只观察24小时左右更不需要了
加抑制剂后加刺激因子，有的是更换掉，需要洗，有的是抑制剂刺激剂加在一起，不需要洗，看你试验的目的需要的。再仔细看看相关文献
我也是刚买了BAY11-7082,20mg/ml，0.1ml，-20度避光保存的，我的疑惑是，不知道这个好不好反复冻融？
阿兰梦 wrote:
uM 是指微摩尔每升吧。先算下你打算配成多少摩尔浓度的，一般10um工作液的话可以先配成10mM或者1mM的母液，再算稀释多少倍到工作浓度
一般高浓度母液也有利于保存。DEMO稀释后保证体积比小1%，不会对细胞造成毒性就可，当然需要加一个溶媒对照组。
DMSO不需要过滤除菌，如果你试验只观察24小时左右更不需要了
加抑制剂后加刺激因子，有的是更换掉，需要洗，有的是抑制剂刺激剂加在一起，不需要洗，看你试验的目的需要的。再仔细看看相关文献
谢谢！基本上解决我的困惑了。
就是这个配制母液的问题还是不太懂，我之前没怎么配过这种液。
另外，我加抑制剂后是再用细胞因子刺激细胞，观察细胞表达某种因子的水平（PCR，ELISA）有无变化，像这种设计不知道需不需要洗；文献也看了好多，但文献中一般都不会讲这么细，只是说先用抑制剂预处理1h，然后再加刺激，中间怎么做的一般都不介绍的。
阿兰梦 wrote:
我也是刚买了BAY11-7082,20mg/ml，0.1ml，-20度避光保存的，我的疑惑是，不知道这个好不好反复冻融？
说明书上没有注明吗？我也不太懂哎，
要不就配成母液后，多分几个管子分装，用时拿一支。
我的这个抑制剂，文献里是提前半小时先加抑制剂，之后换成含或不含刺激剂的培养基，但仍含有抑制剂，有时正文里没详细说，在图表说明里有。
你不妨2种都试试看看什么结果。我倾向于整个过程都加抑制剂，否则除非你的抑制剂是长效稳定而顽固地占有靶点，否则在接下来的n多小时你不能保证抑制剂都起到抑制的作用，完全地抑制了？效力减退只能抑制一小部分了？这就没有说服力了。
你不妨2种都试试看看什么结果。我倾向于整个过程都加抑制剂，否则除非你的抑制剂是长效稳定而顽固地占有靶点，否则在接下来的n多小时你不能保证抑制剂都起到抑制的作用，完全地抑制了？效力减退只能抑制一小部分了？这就没有说服力了。
阿兰梦 wrote:
我的这个抑制剂，文献里是提前半小时先加抑制剂，之后换成含或不含刺激剂的培养基，但仍含有抑制剂，有时正文里没详细说，在图表说明里有。
你不妨2种都试试看看什么结果。我倾向于整个过程都加抑制剂，否则除非你的抑制剂是长效稳定而顽固地占有靶点，否则在接下来的n多小时你不能保证抑制剂都起到抑制的作用，完全地抑制了？效力减退只能抑制一小部分了？这就没有说服力了。
就是说加完抑制剂后，不洗掉，直接加我的刺激吗？另外还需要设含抑制剂但不含刺激剂的组吗？
刚才问了下师兄，师兄的说法和这个类似。
“我倾向于整个过程都加抑制剂，否则除非你的抑制剂是长效稳定而顽固地占有靶点，否则在接下来的n多小时你不能保证抑制剂都起到抑制的作用，完全地抑制了？效力减退只能抑制一小部分了？这就没有说服力了。”
比如开始是2ml的体系里面加了抑制剂，后面直接加入干预因素就行了，只需要保证干预因素的终浓度正确就行了，不需要中途把抑制剂洗掉。不知道我说的对不对。
“我倾向于整个过程都加抑制剂，否则除非你的抑制剂是长效稳定而顽固地占有靶点，否则在接下来的n多小时你不能保证抑制剂都起到抑制的作用，完全地抑制了？效力减退只能抑制一小部分了？这就没有说服力了。”
比如开始是2ml的体系里面加了抑制剂，后面直接加入干预因素就行了，只需要保证干预因素的终浓度正确就行了，不需要中途把抑制剂洗掉。不知道我说的对不对。
我觉得洗不洗不太重要，主要是之前抑制剂的作用，后面都是一样要加处理的。
蛋蛋豆豆 wrote:
我觉得洗不洗不太重要，主要是之前抑制剂的作用，后面都是一样要加处理的。
我觉得还挺重要的，很多信号的抑制剂长时间作用对细胞会造成生长抑制和促进凋亡的作用，即使设置对照，后面的处理引起的效应就大不一样了！
最近我也要做Erk的抑制剂处理呢，也不知道该洗掉还是不洗掉，向大家学习吧……
有谁知道Keap1/Nrf2信号通路的抑制剂吗？求助！！
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师兄微信号：shixiongcoming
