原理
通过特异性阻断PI3K和mTOR，观察HepG2和Hep3B细胞株PI3K/Akt/mTOR信号通路活性及生物学行为的改变，探讨相关的分子机制。
材料与仪器
HepG2人肝癌细胞 Hep3B人肝癌细胞株 人正常肝细胞株QSG-7701
LY294002 Rapamycin 阿霉素
流式细胞仪 荧光显微镜 二氧化碳细胞培养箱 酶标仪 培养板 盖玻片 载玻片
LY294002 Rapamycin 阿霉素
流式细胞仪 荧光显微镜 二氧化碳细胞培养箱 酶标仪 培养板 盖玻片 载玻片
步骤
一、细胞株表达情况监测
1. 在培养的HepG2、Hep3B人肝癌细胞株和人正常肝细胞株QSG-7701上，以免疫印迹方法（Western blot）检测各细胞株中PI3K（p110α亚单位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达情况。
2. 分别用 PI3K抑制剂LY294002（50 umol/ml）和mTOR抑制剂Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育HepG2和Hep3B细胞，以MTT比色法检测细胞的增殖能力，以流式细胞术（Flow cytometry）检测细胞周期和凋亡情况，以Western blot法检测细胞中pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达改变。
1. 在培养的HepG2、Hep3B人肝癌细胞株和人正常肝细胞株QSG-7701上，以免疫印迹方法（Western blot）检测各细胞株中PI3K（p110α亚单位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达情况。
2. 分别用 PI3K抑制剂LY294002（50 umol/ml）和mTOR抑制剂Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育HepG2和Hep3B细胞，以MTT比色法检测细胞的增殖能力，以流式细胞术（Flow cytometry）检测细胞周期和凋亡情况，以Western blot法检测细胞中pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达改变。
二、细胞株表达结果
1. PTEN在HepG2和Hep3B细胞中基本无表达，在QSG-7701细胞株中高表达，pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B细胞中的 表达较QSG-7701细胞均显著升高。
2. LY294002和RAPA均呈剂量-时间依赖的抑制HepG2和Hep3B细胞生长。饱和效应浓度的 LY294002和RAPA作用24小时后，HepG2和Hep3B细胞均呈现明显的G0/G1期阻滞，处于S期的细胞比例较对照组显著减少 （P<0.01）。
3. 两给药组中HepG2细胞和Hep3B细胞的凋亡率与对照组比较均显著增加（P<0.01）。
4. 两给药组HepG2细胞的凋 亡率显著高于Hep3B细胞（P<0.01或P<0.05），并且HepG2细胞的凋亡率在RAPA给药组显著高于LY294002给药组 （P<0.01），但Hep3B细胞的凋亡率在两组间无显著差异。
5. 饱和效应浓度的LY294002作用48小时后，HepG2和Hep3B细胞中 pAkt（T308，S473）和p-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P<0.01），饱和效应浓度的RAPA作用48小时后，HepG2和Hep3B细胞中P-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P<0.01），而pAkt（T308，S473）的 表达水平较对照组均显著升高（分别P<0.01）。
1. PTEN在HepG2和Hep3B细胞中基本无表达，在QSG-7701细胞株中高表达，pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B细胞中的 表达较QSG-7701细胞均显著升高。
2. LY294002和RAPA均呈剂量-时间依赖的抑制HepG2和Hep3B细胞生长。饱和效应浓度的 LY294002和RAPA作用24小时后，HepG2和Hep3B细胞均呈现明显的G0/G1期阻滞，处于S期的细胞比例较对照组显著减少 （P<0.01）。
3. 两给药组中HepG2细胞和Hep3B细胞的凋亡率与对照组比较均显著增加（P<0.01）。
4. 两给药组HepG2细胞的凋 亡率显著高于Hep3B细胞（P<0.01或P<0.05），并且HepG2细胞的凋亡率在RAPA给药组显著高于LY294002给药组 （P<0.01），但Hep3B细胞的凋亡率在两组间无显著差异。
5. 饱和效应浓度的LY294002作用48小时后，HepG2和Hep3B细胞中 pAkt（T308，S473）和p-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P<0.01），饱和效应浓度的RAPA作用48小时后，HepG2和Hep3B细胞中P-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P<0.01），而pAkt（T308，S473）的 表达水平较对照组均显著升高（分别P<0.01）。
三、结果分析
1. HepG2和Hep3B细胞存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的组成性激活。
2. LY294002和RAPA能有效阻断HepG2和 Hep3B细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制HCC细胞的生长增殖，诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，且阻断效应与HCC细胞P53的表达有 关。
3. 一定浓度范围内，HepG2细胞对PI3K/Akt/mTOR信号通路阻断剂的敏感性高于Hep3B细胞，RAPA对PI3K/Akt /mTOR信号通路的部分阻断效应优于LY294002。
1. HepG2和Hep3B细胞存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的组成性激活。
2. LY294002和RAPA能有效阻断HepG2和 Hep3B细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制HCC细胞的生长增殖，诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，且阻断效应与HCC细胞P53的表达有 关。
3. 一定浓度范围内，HepG2细胞对PI3K/Akt/mTOR信号通路阻断剂的敏感性高于Hep3B细胞，RAPA对PI3K/Akt /mTOR信号通路的部分阻断效应优于LY294002。
常见问题
一、PI3K简介
PI3K是细胞内重要的信号转导分子，根据PI3K的P110亚基结构特点和底物分子不同可将其分为三大类，其中第Ⅰ类 PI3K 功能最为重要，下面所述 PI3K 指的都是第Ⅰ类 PI3K。
PI3K主要由催化亚基 P110 和调节亚基 P85 组成。PI3K 可被生长因子、细胞因子、激素等细胞外信号刺激激活。PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化，催化肌醇环上3位羟基生成3,4 二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3,4-biphosphate，PI-3,4P2)及 3,4,5 三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PI-3,4,5P3)，它们均可作为第二信使在细胞中传递信号，介导 PI3K 的多种细胞功能，如这些脂质产物可通过与 Akt 的 PH(pleckstrin homology)区结合来激活Akt。肿瘤抑制基因pten(phosphatase and tensinhomologdelet-edonchromosometen)表达产物可诱导3磷酸肌醇去磷酸化，从而可对 PI3K 途径进行负调节。
二、Akt简介
PI3K是细胞内重要的信号转导分子，根据PI3K的P110亚基结构特点和底物分子不同可将其分为三大类，其中第Ⅰ类 PI3K 功能最为重要，下面所述 PI3K 指的都是第Ⅰ类 PI3K。
PI3K主要由催化亚基 P110 和调节亚基 P85 组成。PI3K 可被生长因子、细胞因子、激素等细胞外信号刺激激活。PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化，催化肌醇环上3位羟基生成3,4 二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3,4-biphosphate，PI-3,4P2)及 3,4,5 三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PI-3,4,5P3)，它们均可作为第二信使在细胞中传递信号，介导 PI3K 的多种细胞功能，如这些脂质产物可通过与 Akt 的 PH(pleckstrin homology)区结合来激活Akt。肿瘤抑制基因pten(phosphatase and tensinhomologdelet-edonchromosometen)表达产物可诱导3磷酸肌醇去磷酸化，从而可对 PI3K 途径进行负调节。
二、Akt简介
Akt是一种Ser/Thr蛋白激酶。在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶(phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK)的协同作用下，PI-3,4P2 和 PI-3,4,5P3 可与Akt结合，导致Akt从胞浆转位到质膜，并促进 Akt 的 Ser473 和 Thr308 位点磷酸化。
Ser473或/和Thr308 位点的磷酸化是Akt激活的必要条件，而Akt激活是其发挥促细胞生存功能的重要前提。激活的 Akt 主要通过促进 Bad(Bcl-2 家族促凋亡成员之一)、mTOR、Caspase 3、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)等下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促细胞生存等功能。
Ser473或/和Thr308 位点的磷酸化是Akt激活的必要条件，而Akt激活是其发挥促细胞生存功能的重要前提。激活的 Akt 主要通过促进 Bad(Bcl-2 家族促凋亡成员之一)、mTOR、Caspase 3、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)等下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促细胞生存等功能。
三、mTOR简介
mTOR也被称为FRAP(FKBP-rapamycin-associated protein)，属于磷酸肌醇激酶3相关激酶(PIKKs)家族的一员，是PI3K/Akt的下游底物，可通过改变翻译调节因子4E-BP1(真核细胞启动因子4E结合蛋白)和 p70S6k的磷酸化状态启动翻译过程。
去磷酸化状态的4E-BP1能与翻译起始因子eIF-4E结合，从而使后者丧失活性，而磷酸化的4E-BP1可解离释放eIF-4E，从而使后者结合于 mRNA 5'端起始点启动翻译过程。p70S6k磷酸化可通过促使40S核糖体蛋白S6磷酸化而启动翻译。PI3K/Akt/mTOR 信号通路在正常和肿瘤细胞的增殖和生存中具有重要作用，以抑制mTOR为主要作用原理的抗肿瘤药物已经进入临床开发的早期阶段。
来源：丁香实验
