1、变性温度和时间：模板 DNA 和 PCR 产物的变性不充分是 PCR 失败的主要原因。适宜的变性条件是 95℃ 30s 或 97℃15s。变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。在变性中，温度太高或反应时间过长，会导致酶活性的损失。Taq DNA 聚合酶活性的半寿期：92.5℃为 2h 以上，95℃为 40min，97℃为 5min。2、复性温度和时间：复性温度决定 PCR 的特异性，而引物退火温度和所需时间长短取决于反应体系中的基本组成及扩增引物的长度和浓度，实际使用的退火温度要比扩增引物的 Tm 值低 5℃。增加退火温度会增加引物的识别，同时可降低引物 3 端核苷酸的错误延伸。因此，提高退火温度，特别是在前几个循环中，会增加扩增的特异性。而且为了在循环开始获得最高的特异性，应在第一次变性之后，引物退火之前加入 Taq DNA 聚合酶。复性时间一般为 30～60s。3、延伸温度和时间：引物延伸温度一般为 72℃，延伸的时间决定于扩增模板的长度，小于 1kb 的片段一般 1～2min，而 10kb 的片段可能需要 15min 或更长时间。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物

P＝0.05 （双侧）rr（较大均方的自由度）n 2234567891012152030600017993648999229379489579639699779859931001101010181239.039.239.239.339.339.339.439.439.439.439.439.439.539.539.52310.015.415.114.914.714.614.514.514.414.314.214.214.114.013.93410.69.989.609.369.209.078.988.908.848.758.668.568.468.368.26458.437.767.397.166.986.856.766.686.626.526.436.336.236.126.01567.266.605.235.995.825.695.605.525.465.375.275.175.064.964.85676.545.895.525.285.124.994.904.824.764.674.574.474.364.254.14786.065.425.054.824.654.534.434

近年来lncRNA的研究进展迅猛，各类 lncRNA 被大量发现，lncRNA的研究将是 RNA 基因组研究领域非常热门的一个方向。小编也正好也在做lncRNA相关的课题，今天就总结一下lncRNA的研究套路和最新研究进展。• LncRNA基本介绍LncRNA：long non-coding RNAs是一类长度大于200nt，但不编码蛋白质的RNAs，广泛存在于动植物中。它们曾长期被误认为是遗传暗物质，但近些年研究证实这类RNAs在生物的生命活动过程中起着重要的调控作用。 特点1. 长度在200-100,000nt2. 没有编码蛋白质潜能3. 具有细胞或组织类型特异性4. 表达量和保守性比mRNA低5. 部分lncRNA不含有polyA尾巴6. 部分也会翻译小肽段 • LncRNA功能及作用形式 功能1. 结合转录因子，干扰其靶基因，从而调控转录2. 作为分子海绵，吸附miRNA3. 与调节蛋白结合，影响蛋白多聚物的形成4. 招募染色质修饰因子，改变染色质的修饰水平5. 与mRNA配对结合，

一、miRNA的靶基因寻找研究表明，一个基因可以受多个miRNA调控，而一种miRNA又可以参与调控多个靶基因，据预测，至少有30%的人类基因是miRNA的靶基因。这就足以显示出miRNA群体的重要性。而在人类疾病中多不同程度的表现出大量miRNA的上调和下调，这也足以显示miRNA在疾病发生过程中占据着非常重要的作用。而探讨miRNA的功能作用中最重要的一步就是高效准确的寻找到其所调控的靶基因。目前寻找靶基因主要是从以下两个方面入手。1．生物信息学方法miRNA靶基因的预测主要是根据生物信息学的方式进行，主要是根据以下几个方面进行预测：①miRNA与靶基因结合位点的互补性；②miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；③miRNA-mRNA结合的热稳定性；④miRNA靶位点处不应有复杂二级结构；⑤miRNA5′端与靶基因的结合能力强于3′端。除以上几个基本原则外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行不同的限制与优化。目前比较常用的靶基因预测软件有：miRanda、TargetScan、PicTar、miRWalk、miRanda、miRDB等，其中在miRWalk中可以查找到已

如果一个家系被评估适合进行遗传性肿瘤基因检测，接下来的问题是要决定哪些家庭成员是进行检测的最佳人选？✦ 一般来说，最理想的情况下，最合适/最佳的人选应该是先征者（患癌者），他是最有可能携带基因突变的那个人；或者家系中的肯定携带者，比如某个个体的父母和子女中有人曾患某种综合征相关肿瘤。✦ 如果家系中患者去世（或不能检测），应先检测该家系中患者的直系亲属。其实，从遗传学角度来看，检测的目的是确定家系肿瘤的潜在原因，也就是为了得到阳性检测结果。检测一个 50% 风险携带基因突变的个体比检测有 12.5% 几率携带突变的表亲更有意义！✦ 如果家系同时患癌，一般建议检测肿瘤发病年龄最小的成员。不过对于儿童检测应更谨慎，对儿童检测成年发病的遗传性肿瘤综合征很少能得到任何医疗益处。✦ 如果个人和家族病史可能提示可检测两个或更多不同的肿瘤综合征（个人和家族史的偏向性不一样），这时候一般建议同时检测多种肿瘤综合征，查出答案的可能性更大些。遗传性肿瘤基因检测的流程对于专业内的人士并不陌生，对于大众来说可能就是比较高大尚的东西，整体的步骤为：知情同意书 → 申请表 → 签字 → 付款 → 样本采集（唾液/血

根据陆国辉老师《临床遗传咨询》一书，遗传性肿瘤主要有如下特点：家族里同时出现多个患有相同或者相互间关系密切的肿瘤的病人：比如，亲人中既有患乳腺癌的，又有患卵巢癌的。发病年龄小：一般我们认为50岁以上患的肿瘤更倾向于是散发的（非遗传性的），若有家属50岁之前得了恶性肿瘤，应该更加重视。常染色体显性遗传模式：也就是说，肿瘤病人在家族里大多呈纵向分布，即从上一代往下一代传递。罕见肿瘤的出现：肿瘤在异常人群里出现，说明患遗传性肿瘤可能性大，例如男性患了乳腺癌。多个或者双侧肿瘤的出现：比如双侧乳腺癌，双侧肾癌，双侧视网膜母细胞瘤。多个原发性肿瘤在同一个病人身上出现：如一个患者既有原发性肠癌，又有原发性卵巢癌。非肿瘤临床表现的出现：如Cowden综合征，该疾病是一种罕见的常染色体显性遗传病，主要表现为多重错构瘤及某类肿瘤发生风险的增加。临床表现多种多样，包括乳腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌等，皮肤方面表现为口腔及皮肤乳头状瘤，胃肠方面表现为混合性息肉（包括错构瘤）。无外环境风险因素的发现：一般我们认为肿瘤是复杂疾病，肿瘤的发生是遗传因素与环境因素（包括与致癌物质的接触）共同作用的结果。外环境条件不存在

据估计，人类中约有5%~10%肿瘤是由于某些基因的种系变异（胚系突变）遗传而发生的。虽然这些肿瘤在肿瘤总负荷中所占比例不大，但对于携带这些种系变异的个人和家族来说，危害几乎是100%的！几乎是100%的！几乎是100%！（重要的事情说三遍！）因此，对特定的高危人群和个体进行变异基因检测，并对携带者进行有效的防治和干预，是现在肿瘤医学的重要发展趋势。所以，对于那些有家系肿瘤史，可能会有阳性检测结果者就有必要进行特定的遗传性肿瘤综合征基因检测。

遗传性肿瘤相关基因的解读是根据国际癌症研究机构（IARC）､美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）和胚系突变等位基因解读实证联盟（ENIGMA）等给出的分类等级： 很多人在咨询做遗传性肿瘤基因检测时都有这样的疑虑：如果检测到携带遗传易感基因就一定得肿瘤吗？如果没有就肯定不会得肿瘤吗？其实，并不是携带了遗传性肿瘤的易感基因，就 100% 得肿瘤，遗传性肿瘤基因检测的重点在于针对性地预防。遗传性肿瘤患者有 50% 的概率会遗传给后代，如果是有家族史的健康人群，做基因检测可以帮助他们了解自己是否有罹癌风险。若不幸结果是阳性，那么就要针对性的预防相关肿瘤的发生；如果是阴性的结果，就不用过多的担心。但阴性结果并不意味着就肯定不会得肿瘤了，因为肿瘤的发生也受后天因素的影响，环境、生活习惯等等也与肿瘤的发生有关，所以，保持一个好的生活习惯很重要。

用钩镊再眼眶处固定大鼠颅骨，用组织剪再颅骨和颈椎连接处剪断。 组织剪头部伸入枕骨大孔，尽量贴着骨头。 组织剪从枕骨大孔处伸入，朝向同侧眼眶方向，贴着骨头剪，剪到眼眶。 右侧同上 从大鼠眼眶之间剪断 左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅骨（有点残忍），用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨头，直接就掀起来了，完整的脑组织就显现出来了，下图为灌注后的脑组织。 从小脑处将脑组织向上推起，用小剪刀剪断脑神经。最后向为医学献身的动物们致敬！

网友eming43的经验支原体的检测． PCR法原理 该法是通过PCR技术将支原体16srRNA基因特异性扩增，来检测培养细胞中污染的支原体。PCR引物选自16sr RNA基因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经溴乙啶（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。u 16sr DNA引物用水稀释至40umol/L。　　（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’　　（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’2) PCR扩增（1） 在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物，对每个样品均加入：　　10X PCR缓冲液 5.0ml　　25mmol/L dNTPs 混合物 0.4ul　　40umol/L 16sr DNA引物 每种引物1.0ul　　40umol/L pBR322 DNA 引物 每种 2.0ul　　pBR322 DNA 1pg/ml 2.0ul　　DNA聚合酶（5U/ml） 0.2ul　　三蒸水 35.4ul　　总量 45ul（2） 用无菌去离子水稀释样品为1:

污染测试--支原体 :PCR方法原理：利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。材料与设备：ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.　　提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture　　positive control DNA (A. laidlawii ; M.

最近看大家常提到支原体污染，就翻了翻书，做了些笔记，现在贴出来和大家分享： 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。 支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。 支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6—8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 支原体污染细胞后。培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解。因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢。甚至从培养器皿脱落。 为确定有无支原体污染可做如下检酗： ①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间

在园子里经常看到询问冻存、复苏细胞的方法和注意事项。故介绍一些致命的 “败笔”，和解决方法。 希望对大家有帮助。（ 以 Raji 为例）一、细胞冻存：1. 错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已 经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。解决：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。2. 细胞太少：冻存时细胞浓度低于 1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。解决：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。3. 盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子 / 型号的颜色会有差别）。4. 单薄的冻存盒：放在－80 度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）5. -80 度太久：放在－80 度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定：开门 / 关门，电压不稳等）解决：尽快转入液氮。6. 液氮不足：液面不能漫过所有细胞。解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。7. 取错细胞：找不到

对于贴壁生长的细胞，相对来说比较简单但也很麻烦。以下我主要讨论贴壁生长的细胞。在讨论之前，大家首先要有一个概念，即洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！1）.将污染的培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。2）.继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。3）.继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。4）.重复步骤3再洗。5）.重复步骤3再洗。6）.加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。7）.加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒

相关专题那些实验室常用的克隆载体pUC18 和 pUC19质粒图谱pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注册号为 L08752(pUC18)和 X02514(pUC19)。由 pBR322 改造而来，其中 lacZ (MSC)来自 M13mp18/19 图 3-4 是其质粒图谱 。这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组 质粒。特征序列区位：&NBS p;pBR322_origin&NBS p;1471 - 852Ampicillin 2486 - 1626lac_promoter 543 - 514AmpR_promoter 2556 - 2528M13_pUC_rev_primer 500

时期 胎龄（日）胚胎发育小鼠大鼠111单核细胞（输卵管内）2 22 细胞期（输卵管内）323.254 细胞期（输卵管内）42.53.58-12 细胞期（输卵管内）533.桑椹期（输卵管—子宫上部）63.54囊胚初期（子宫内）745囊胚期84.56植入开始956.75内外胚层分化105.57.25植入末期，卵黄腔形成，分化成内外胚层，116.57.75植入完毕，出现羊膜。1278.5出现中胚层和原条。137.59出现神经板，头部突起，出现尿膜褶。147.759.5体节 1-4（头部）完成外层胎盘。158～8.510腔，胚外体腔内和羊膜腔发育。体节 5-12（颈椎部） 形成神经沟，胚回转开始。168.5～910.5体节 13-20（胸椎前部）胚回转结束。179.511体节 21-25（胸椎后部），神经沟闭锁。181011.5体节 26-28（腰椎前部），前肢出现。1910.2511.75体节 29-31（腰椎后部），后肢出现。20 体节 32-33（荐椎后部）。21 12体节 34、35（荐椎后部）。2210.5 体节 36（第一层尾椎）鼻窝形成23 体节 37、38（尾椎）。24

一、饲养环境小鼠对环境的适应性的自体调节能力和疾病抗御能力较其他实验动物差，而小鼠的品种和品系繁多，各个品种和品系都有自己的特殊要求，因此必须根据实际情况给予一个清洁舒适的生活环境。不同等级的小鼠应生活在相应的设施中。小鼠临界温度为低温 10℃，高温 37℃，温度中性范围 30～33℃。饲养环境控制应达到如下要求：温度 18～29℃；相对湿度 40～70％；最好控制在 18～22℃,湿度 50～60％。一般小鼠饲养盒内温度比环境高 1～2℃，湿度高 5～10％。要保持温度、湿度相对稳定，日温差不超过 3℃,否则会直接影响小鼠的生长发育、生产繁殖、甚至导致小鼠发生疾病，从而影响实验结果。温湿度的相对稳定对于建筑条件较差的地方可用空气调节器、加湿器、在北方用暖气进行调节。为了保持室内空气新鲜，氨浓度不超过20ppm，换气次数应达到 10～20次／小时。现在我国普遍采用无毒塑料鼠盒，不锈钢丝笼盖，金属笼架。笼架一般可移动，并可经受多种方法消毒灭菌。用清洁层流架小环境控制饲养二、三级小鼠不失为一种较好的方法。笼盒既要保证小鼠有活动的空间，又要阻止其啃咬磨牙咬破鼠盒逃逸，便于清洗消毒。带滤帽的笼

一、小鼠的行为和习性1. 小鼠胆小，易于受惊，对外界环境的改变反应敏感。受惊时,尾巴挺直并猛力甩动，如强光或噪声刺激可导致哺乳母鼠神经紊乱，发生食仔现象。2. 小鼠在人工驯养条件下,性情温顺易于捕捉，一旦逃出笼外过夜则恢复野性，行动敏捷难以捕捉。3. 小鼠喜欢阴暗，固定一处睡眠营巢。傍晚活动加强，夜间更加活跃， 其进食、交配、分娩多发生在夜间。4. 小鼠是典型的啮齿动物，门齿终生生长。因此小鼠有啃咬习惯， 以此来磨损门齿并保持其长短的恒定。5. 小鼠为群居动物，当群饲时，其饲料消耗量比单个饲养时多，生长发育也快。6. 小鼠群体中性成熟的雄鼠放在一起易发生互斗。 源于一窝的雄鼠或断奶后同笼饲养的雄鼠间则较少攻击。外来雄鼠常招致几只雄鼠的集体攻击。群居优势在雄性很明显，表现为群体中处于优势者保留胡须,被称为“理发师”,而处于劣势者胡须被拔光。这一现象应与因寄生虫性或真菌性皮炎所致的掉毛相区别。雄鼠具有分泌醋酸胺臭气的特性，是小鼠饲养室内特异臭气的主要原因。7. 小鼠对外界温度的变化特别是低温非常敏感，由于运输、 环境改变而致低温可很快引起小鼠死亡。 二、解剖学特点1. 外观小鼠体形小，90

环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子,也是RNA领域的研究热点。circRNA分子呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点,在细胞中充当miRNA分子海绵(miRNA sponge),可以解除miRNA对其靶基因的抑制作用。在circRNA的研究中,设计出特异的circRNA引物极为关键。以下简介在circRNA的研究中,如何准确快速获得感兴趣circRNA序列并设计对应的环状RNA引物。一、序列查询如果已经知道circRNA的数据库ID,可以在circRNA数据库如:circBase中进行查找:1.首先,进入circBase主页,http://circbase.org/,输入circRNA的ID。 2.点击Search,进入搜索结果,在结果界面中提供了circRNA的种属、染色体位置、ID、基因组中序列长度、剪接后RNA长度、文献等相关信息,点击FASTA3.进入如下界面,选择spliced后点击最下方的search键。4.即可下载FASTA格式的circRNA序列,下载的文件可以用记

导读今年4月，《molecular Cell》杂志上刊登了一篇基于高通量测序方法研究肌细胞分化过程中circRNA功能性文章。通过RNA-Seq筛选人和老鼠（C2C12）肌母细胞（myoblasts ）分化成肌管细胞（myotubes ）过程以及肌营养不良症（DMD）状态下差异表达的circRNA，然后利用RNA干扰（RNAi）技术找到在肌肉分化过程中起作用的circRNA。更有趣的是，作者发现其中一个circRNA序列中含有开放阅读框（ORF），从而又进一步证明其具有编码蛋白的能力。由于文章内容充实丰富，小编决定分两次给大家详细解读，本次重点阐述高通量数据分析部分。 一、样本介绍本文所研究的样本是人和小鼠（C2C12）的肌母细胞（myoblasts ，GM）以及诱导分化后的肌管细胞（myotubes ,DM），每个样本有A,B两个重复进行RNA-Seq（在circRNA进行差异表达分析中，作者还用到了人肌营养不良（DMD）样本）。作者采用FindCirc软件流程检测circRNA，结果如下表：表1 Number of detected linear and circular spli