肿瘤组织如何提取分离外泌体？

外泌体（Exosomes）是细胞分泌到胞外的一种囊泡，大小为 30-150 nm，携带了各种核酸、蛋白质和脂类等物质，可以在不同细胞间进行传递和交流，从而影响受体细胞的生物学功能。

肿瘤细胞来源的外泌体不仅能帮助肿瘤细胞自身发生侵袭和转移，也能促进肿瘤微环境其他细胞的状态发生改变。外泌体在肿瘤中起的作用若要深入研究，这就需要我们拿到更多的肿瘤来源的外泌体。

目前肿瘤方向的研究多使用肿瘤细胞的培养上清来提取外泌体，但是现在我们可以直接利用肿瘤组织来提取外泌体，一方面减少了大量体外培养细胞的工作，另一方面利用肿瘤组织提取得到的外泌体，可能更接近于生理状态下的外泌体，也有利于研究外泌体的功能。

重点来了！那如何从肿瘤组织中分离提取外泌体呢，效果又如何？下面和大家分享我们自己从肿瘤组织中提取外泌体的效果，供大家参考：

一、采用消化+滤筛过滤+超离法从肿瘤组织中分离外泌体：

将肿瘤组织切成小块，加入胶原酶孵育，再经过滤筛过滤，随后进行一系列的差速超速离心过程，包括除杂、超离等，最终用 PBS 重悬外泌体，用重悬后的外泌体进行接下来的透射电镜（TEM）、纳米粒径跟踪分析（NTA）和 WB marker 鉴定。

二、TEM 鉴定外泌体形态：

将提取的外泌体样本置于冰盒中，使用移液枪吸取外泌体样本于铜网上静置 1 min。(用镊子夹铜网要轻，防止铜网夹破)。再将铜网上的外泌体样本吸干，使用移液枪吸取醋酸双氧铀染色液室温染色。随后将染色完成的样本放于灯下烤。样本制好后，观察拍照，保存图片。结果如下：

图一 TEM 鉴定外泌体的形态

从 TEM 结果中可以看出，从肿瘤组织中分离得到的外泌体具有典型的杯托状结构，且数量比较多。

三、NTA 鉴定外泌体的大小和颗粒浓度：

准备外泌体样本，并将外泌体样本置于仪器中检测。检测结果如下：

图二 NTA 鉴定肿瘤组织外泌体大小

从 NTA 结果中可以看出，检测到的外泌体颗粒大小在 30-150 nm范围，符合外泌体的大小，且颗粒浓度在 undefined10 的 10 次方以上（由图中 particles 数乘以稀释倍数）。

四、WB 鉴定外泌体的蛋白 marker：

按照实验室常规操作进行外泌体样本的 WB 实验。本次测试选择了两个蛋白指标进行外泌体蛋白鉴定，即 CD9、TSG101。WB 结果如下（点样顺序从左至右分别为 Marker、外泌体-1、外泌体-2、外泌体-3、外泌体-4、外泌体-5、外泌体-6、脑样本、293T 阳性样本）：

图三 WB 鉴定肿瘤组织外泌体蛋白 marker

从 WB 结果可以看出，由于外泌体 1-6 样本是取不同重量的肿瘤组织提取的外泌体，得到的外泌体量不同，所以 WB 呈现的条带深浅不一样。CD9 和 TSG101 在外泌体样本中呈现阳性结果（根据最右边的阳性条带可以判断大小基本相似），符合外泌体的蛋白特征。

本次测试使用了胶质瘤和黑色素瘤两种瘤块，从以上三种常用的外泌体鉴定方法中可以看出，我们建立的肿瘤组织分离外泌体方法是可行的，能顺利获得需要的外泌体。

但是方法中也存在一些不足，从电镜结果中可以看出，样本中可能还有一些杂质掺杂，如果要进一步除杂，可能就要面临损失很多外泌体的风险，所以经常遇到的问题是外泌体的纯度和含量很难二者兼得，这是外泌体分离目前一直存在的问题。

参考文献：J Extracell Vesicles. 2020 Feb 11;9(1):1722433. doi: 10.1080/20013078.2020.1722433. eCollection 2020.