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外泌体提取纯化(粪便)

相关实验:外泌体提取纯化

最新修订时间:

材料与仪器

实验原料:粪便(新鲜或者 4℃ 存储样品)

试剂耗材:

1. 外泌体提取试剂盒

2. 针式过滤器(0.45µm)

3. PBS 缓冲液(2℃ ~ 8℃ 预冷)

步骤

一、样品预处理

(1)粪便样本收集在无菌的宽口容器中,立即使用(收集样品后置于冰上)或冷藏(4°C)。

(2)使用勺子将 3g 的粪便转移到预先称重的离心管中,向试管中加入预冷(2℃ ~ 8℃)的 30 毫升无内毒素 PBS(按照每1g 粪便对应 10 毫升 PBS 加入)。

(3)通过涡旋振荡器充分混匀粪便样本 5 分钟。在此步骤中,将高速离心机和离心转子冷却至 4°C。

(4)将混匀粪便的离心管放入高速离心机中,在 4°C,8000g 的温度下离心 10 分钟。

(5)收集滤过液,使用移液器将其转移到新的离心管中,在 4°C,10000g 的温度下离心 10 分钟。

(6)收集滤过液,通过针式过滤器(0.45µm)进行过滤,收集滤过液。

二、提取外泌体

(1)滤过液预处理:在去除杂质的离心滤过液中加入 Exosome Concentration Solution(ECS 试剂),具体的加入剂量如下:(其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算)

样品名称

样品剂量

加入 ECS 剂量

粪便滤过液

20 mL

5 mL

(2)溶液混合:加入 ECS 试剂后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器混匀 1min,再放置于 4℃ 静置至少 2h;(增加静置时间可提高外泌体得率,但静置时间不可超过 24h)

(3)沉淀外泌体:取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10000g 离心 60min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒;(注:尽可能吸净滤过液)

(4)外泌体重悬:取 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物(具体加入剂量如下表),待其溶解后,将重悬液转移至新的 1.5mL 离心管中;

样品体积

加入 PBS 剂量

20 mL

0.2 mL

注:其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

(5)收获外泌体颗粒:将含有重悬液的 1.5mL 离心管于 4℃ 以 12000g 离心 2min,保留滤过液,该滤过液中富含外泌体颗粒。(注:若沉淀较多,可 12000g / 2min 离心多次至无明显沉淀,每次取离心滤过液)

三、纯化外泌体

(1)纯化外泌体:将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter(EPF 柱)上室中,于 4℃ 以 3000g 离心 10min,离心后收集EPF柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒;(注:EPF 柱不可重复使用)

(2)外泌体的保存:纯化后的外泌体以 50 ~ 100μL 进行分装保存于 -80℃ 低温冰箱中,以备后继实验使用。

来源:丁香实验

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