外泌体提取纯化（粪便）

实验原料：粪便（新鲜或者 4℃ 存储样品）

试剂耗材：

1. 外泌体提取试剂盒

2. 针式过滤器（0.45µm)

3. PBS 缓冲液（2℃ ~ 8℃ 预冷）

一、样品预处理

（1）粪便样本收集在无菌的宽口容器中，立即使用（收集样品后置于冰上）或冷藏(4°C)。

（2）使用勺子将 3g 的粪便转移到预先称重的离心管中，向试管中加入预冷(2℃ ~ 8℃)的 30 毫升无内毒素 PBS（按照每1g 粪便对应 10 毫升 PBS 加入）。

（3）通过涡旋振荡器充分混匀粪便样本 5 分钟。在此步骤中，将高速离心机和离心转子冷却至 4°C。

（4）将混匀粪便的离心管放入高速离心机中，在 4°C，8000g 的温度下离心 10 分钟。

（5）收集滤过液，使用移液器将其转移到新的离心管中，在 4°C，10000g 的温度下离心 10 分钟。

（6）收集滤过液，通过针式过滤器(0.45µm)进行过滤，收集滤过液。

二、提取外泌体

（1）滤过液预处理：在去除杂质的离心滤过液中加入 Exosome Concentration Solution（ECS 试剂），具体的加入剂量如下：（其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算）

样品名称	样品剂量	加入 ECS 剂量
粪便滤过液	20 mL	5 mL

（2）溶液混合：加入 ECS 试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1min，再放置于 4℃ 静置至少 2h；（增加静置时间可提高外泌体得率，但静置时间不可超过 24h）

（3）沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10000g 离心 60min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净滤过液）

（4）外泌体重悬：取 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物（具体加入剂量如下表），待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5mL 离心管中；

样品体积	加入 PBS 剂量
20 mL	0.2 mL

注：其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

（5）收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5mL 离心管于 4℃ 以 12000g 离心 2min，保留滤过液，该滤过液中富含外泌体颗粒。（注：若沉淀较多，可 12000g / 2min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心滤过液）

三、纯化外泌体

（1）纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3000g 离心 10min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；（注：EPF 柱不可重复使用）

（2）外泌体的保存：纯化后的外泌体以 50 ~ 100μL 进行分装保存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后继实验使用。