外泌体提取纯化（体液）

器材：高速离心机，涡旋振荡器

试剂：Exosome Concentration Solutioundefined 18 mL, 1 × PBS缓冲液（无菌），Umibio 外泌体提取试剂盒体液）

耗材：1.5 mL 离心管，Exosome Purification Filter * 30 Tubes

一、样品预处理

1、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25 ℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

2、样品初始用量：单次提取时的样品量建议肺泡灌洗液、腹水等不低于 1 mL，建议 1 次提取 2-3 mL 体积；

3、离心去细胞碎片：将样品转移至离心管中，于 4℃ 以 3,000 ×g（~6,200 rpm）离心10 min，去除样品中的细胞碎片（注：若沉淀较多，可 3,000 ×g，10 min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）；

 7 cm 有效离心半径的小离心机换算（≤2 mL 离心管），下同。

4、离心去杂质碎片：将离心上清液转移至新的离心管中，于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 10 min，去除样品中的杂质碎片；

5、上清液转移：去除杂质碎片的上清液转移到新离心管中。

二、提取外泌体

1、上清液预处理：在去除杂质的离心上清液 中加入 Exosome Concentration Solution (ECS 试剂)，具体的加入剂量如下（注：其他剂量规格请根据表中的试剂用量等比例换算）

样品名称	样品剂量	ECS 剂量
肺泡灌洗液	1.0 mL	0.25 mL
腹   水	1.0 mL	0.25 mL

2、溶液混合：加入 ECS试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1 min，再放置于 4 ℃静置 8 h以上（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24 h）；

3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 30 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒（尽可能吸尽上清液）；

4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 2 min，弃上清（注：尽可能吸尽上清液）；

5、外泌体重悬：取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中（建议每 1 mL 体液用 100 μL 左右 1×PBS 重悬）；

6、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 2 min，保留上清液，其中富含外泌体颗粒（注：若沉淀较多，可 12,000 ×g，2 min 离心多次至无明显沉淀，每次取上清液）。

三、纯化外泌体

1、纯化外泌体：将收获的同一体液来源的外泌体颗粒粗品合并转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3,000 ×g（~6,200 rpm）离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒（注：EPF柱不可重复使用）；

2、外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后续实验使用。