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外泌体提取纯化(体液)

相关实验:外泌体提取纯化

最新修订时间:

材料与仪器

器材:高速离心机,涡旋振荡器

试剂:Exosome Concentration Solutioundefined 18 mL, 1 × PBS缓冲液(无菌),Umibio 外泌体提取试剂盒体液)

耗材:1.5 mL 离心管,Exosome Purification Filter * 30 Tubes

步骤

一、样品预处理

1、取样:如果是冻存样品,从冰箱取出后于 25 ℃ 水浴中进行解冻,将完全融化后的样品置于冰上;如果是新鲜样品,收集样品后置于冰上;

2、样品初始用量:单次提取时的样品量建议肺泡灌洗液、腹水等不低于 1 mL,建议 1 次提取 2-3 mL 体积;

3、离心去细胞碎片:将样品转移至离心管中,于 4℃ 以 3,000 ×g(~6,200 rpm)离心10 min,去除样品中的细胞碎片(注:若沉淀较多,可 3,000 ×g,10 min 离心多次至无明显沉淀,每次取离心上清液);

 7 cm 有效离心半径的小离心机换算(≤2 mL 离心管),下同。

4、离心去杂质碎片:将离心上清液转移至新的离心管中,于 4℃ 以 12,000 ×g(~12,400 rpm)离心 10 min,去除样品中的杂质碎片;

5、上清液转移:去除杂质碎片的上清液转移到新离心管中。

二、提取外泌体

1、上清液预处理:在去除杂质的离心上清液 中加入 Exosome Concentration Solution (ECS 试剂),具体的加入剂量如下(注:其他剂量规格请根据表中的试剂用量等比例换算)

样品名称

样品剂量

ECS 剂量

肺泡灌洗液

1.0 mL

0.25 mL

腹   水

1.0 mL

0.25 mL

2、溶液混合:加入 ECS试剂后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器混匀 1 min,再放置于 4 ℃静置 8 h以上(注:增加静置时间可提高外泌体得率,但不可超过 24 h);

3、沉淀外泌体:取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 12,000 ×g(~12,400 rpm)离心 30 min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒(尽可能吸尽上清液);

4、再次离心:将含有沉淀的离心管再次于 4℃ 以 12,000 ×g(~12,400 rpm)离心 2 min,弃上清(注:尽可能吸尽上清液);

5、外泌体重悬:取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物,待其溶解后,将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中(建议每 1 mL 体液用 100 μL 左右 1×PBS 重悬);

6、收获外泌体颗粒:将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃ 以 12,000 ×g(~12,400 rpm)离心 2 min,保留上清液,其中富含外泌体颗粒(注:若沉淀较多,可 12,000 ×g,2 min 离心多次至无明显沉淀,每次取上清液)。

三、纯化外泌体

1、纯化外泌体:将收获的同一体液来源的外泌体颗粒粗品合并转入 Exosome Purification Filter(EPF 柱)上室中,于 4℃ 以 3,000 ×g(~6,200 rpm)离心 10 min,离心后收集 EPF 柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒(注:EPF柱不可重复使用);

2、外泌体的保存:纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于 -80℃ 低温冰箱中,以备后续实验使用。

来源:丁香实验

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