外泌体提取纯化（体液）

1、高速离心机（可以达到 10000g 离心力），

2、1×PBS 缓冲液（无菌）；

试剂盒组分：

组分名称	规格
Exosome Concentration Solution (from other body fluids)	15 mL
Exosome Purification Filter	30 Tubes

一、样品预处理

1. 取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

2. 样品初始用量：（单次提取时的样品量）

样品名称	最低量
肺泡灌洗液	1.0 mL
腹水	1.0 mL

3. 离心去细胞碎片：将样品转移至离心管中，于 4℃ 以 3000g 离心 10min，去除样品中的细胞碎片；

4. 上清液转移：去除细胞碎片的离心上清液转移到新的离心管中；

5. 离心去杂质：转移后的上清液于 4℃ 以 10000g 离心 10min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中。（注：若沉淀较多，可 10000g/10min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）

二、提取外泌体

1. 上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入 Exosome Concentration Solution (ECS 试剂)，具体的加入剂量如下（注：其他剂量规格请根据表中的试剂用量等比例换算）

样品名称	样品剂量	ECS 剂量
肺泡灌洗液	2.0 mL	0.5 mL
腹 水	2.0 mL	0.5 mL

2. 溶液混合：加入 ECS 试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1min，再放置于 4℃ 静置 2h；

3. 沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10000g 离心 60min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）

4. 外泌体重悬：取 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物（具体加入剂量如下表），待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5mL 离心管中；

样品体积	加入 PBS 剂量
2 mL	0.2 mL

（注：其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算）

5. 收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5mL 离心管于 4℃ 以 12000g 离心 2min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。（注：若沉淀较多，可 12000g /2min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）

三、纯化外泌体

1. 纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3000g 离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；（注：EPF 柱不可重复使用）

2. 外泌体的保存：纯化后的外泌体以 50~100μL 进行分装保存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后继实验使用。