外泌体提取纯化（血液）

器材：高速离心机（可达到 10 000 g 离心力）、涡旋振荡器、2 mL 离心转子、1.5 mL 离心管；

试剂：1×PBS 缓冲液（无菌）、Blood PureExo Solutioundefined（BPS）30 mL、Exosome Purification Filteundefined30 Tubes。

一、样品预处理

1、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25 ℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

2、样品初始用量：（单次提取时的样品量）

样品名称	最低量
血清	0.2 mL
血浆	0.2 mL

3、离心去细胞碎片：将样品转移至离心管中，于 4 ℃ 以 3 000 g 离心 10 min，去除样品中的细胞碎片；

4、上清液转移：去除细胞碎片的离心上清液转移到新的离心管中；

5、离心去杂质：转移后的上清液于 4 ℃ 以 10 000 g 离心 10 min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中。（注：若沉淀较多，可 10 000 g/10 min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）

二、提取外泌体

1、上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中先加入预冷的 1×PBS 进行稀释，再加入 Blood PureExo Solution（BPS）；具体的加入剂量如下（注：其他剂量规格请根据表中的试剂用量等比例换算）

样品名称	样品剂量	PBS 剂量	BPS 剂量
血清	1.0 mL	3.0 mL	1.0 mL
血浆	1.0 mL	3.0 mL	1.0 mL

2、溶液混合：加入 BPS 试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1 min，再放置于 4 ℃ 静置 2 h；

3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4 ℃ 以 10 000 g 离心 60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）

4、外泌体重悬：取 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物（具体加入剂量如下表），待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中；

血清血浆样品体积	加入 PBS 剂量
0.2 mL	0.1 mL

（注：其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算）

5、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4 ℃ 以 12 000 g 离心 2 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。（注：若沉淀较多，可 12 000 g/2 min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）

三、纯化外泌体

1、纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4 ℃ 以 3 000 g 离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；（注：EPF 柱不可重复使用）

2、外泌体的保存：纯化后的外泌体以 50~100 μL 进行分装保存于 -80 ℃ 低温冰箱中，以备后继实验使用。