外泌体提取纯化（乳液）

高速离心机（可达到 10000g 离心力），涡旋振荡器；50mL 离心转子，50mL 离心管，2mL 离心转子，1.5mL 离心管，PBS 缓冲液。

试剂盒组分：

组分名称	规 格
Solution A	50 mL
Solution B	50 mL
Solution C	50 mL
Solution D	100 mL
50mL 离心过滤柱	20 个

一、样品预处理

1. 取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

2. 样品初始用量：（单次提取时的样品量）

样品名称	单次最佳处理体积
乳液	50 mL

3. 离心去脂：将样品转移至离心管中，于 4℃ 以 10000g 离心 20min，去除样品中的脂质及部分蛋白；（注：离心后样品分为三层，上层为脂质层，下层为蛋白沉淀，中间层为乳清。离心后上层状态为“致密、稳定、不易脱落”，若上层“松软、易脱落”且下层沉淀较多，可继续重复此步骤，每次离心取中间层液体）

4. 乳清转移：将去除脂质的乳清（中间层液体）转移至新的 50mL 离心管中；（注：可用枪头将上层脂质戳破后缓慢倾倒，或用移液器转移，转移后的乳清中带有少量脂质和沉淀是正常现象，不影响后续实验。）

二、去除杂蛋白

1. 乳清澄清：乳清中加入 Solution A，将离心管颠倒混匀至呈现“半透明状”，再加入 Solution B，颠倒混匀后于 2℃ 至 8℃ 静置 10min；（注：静置完成后轻轻晃动离心管，呈现 “豆花状“固体，液体部分为”透明状“。若未呈现“豆花状”或样品仍为”乳白色“，可再适当加入 Solution B 至液体为”透明状“。）

乳清体积	Solution A 剂量	Solution B 剂量
40 mL	4 mL	3 mL

注：具体加入剂量请根据上表等比例换算

2. 离心去蛋白：将澄清后的乳清于 4℃ 以 10000g 离心 10min，收集上清液；

3. 上清液过滤：将收集的上清液转移至 50mL 离心过滤柱中，于 4℃ 以 3000g 离心 2min；(注：若未过滤完全，可重复此步骤。50mL 离心过滤柱为一次性耗材，不建议重复使用。)

4. 将过滤后的上清液转移至新离心管中，加入 Solution C 后颠倒混匀；（注：Solution C 加入剂量和 Solution B 剂量保持一致）

离心过滤后样本体积	Solution C 剂量
40 mL	3 mL

三、提取外泌体

1. 上清液预处理：在加入 Solution C 后的上清液中加入 Solution D，具体加入剂量如下：

样品剂量	加入 Solution D 剂量
40 mL	10 mL

注：其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

2. 溶液混合：加入 Solution D 后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1min，再放置于 2℃ 至 8℃ 静置至少 2h；（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但静置时间不可超过 24h）

3. 沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10000g 离心 60min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）

4. 外泌体重悬：取 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物（具体加入剂量如下表），待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5mL 离心管中；

样品体积	加入 PBS 剂量
40 mL	1 mL

注：其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

5. 收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5mL 离心管于 4℃ 以 12000g 离心 5min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。（注：若沉淀较多，可重复该步骤多次至无明显沉淀，每次取离心上清液。外泌体溶液可能带有淡淡的乳白色，此为正常现象）

6. 外泌体的保存：纯化后的外泌体以 50 ~ 100 μL 进行分装保存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后继实验使用。