外泌体提取纯化（乳液）

器材：高速离心机，涡旋振荡器

试剂：Solution A * 50 mL ，Solution B/C * 60 mL，Solution D * 120 mL， 1 × PBS缓冲液（无菌），Umibio 外泌体提取试剂盒（乳液）

耗材：50 mL 离心管，1.5 mL 离心管，50 mL 离心过滤柱 _20_个

一、样品预处理

1、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

2、样品初始用量：单次提取时的乳液量建议不低于 25  mL；

3、离心去脂：将样品转移至离心管中，于 4℃ 以10,000 ×g（~9,500 rpm）离心 20 min，去除样品中的脂质及部分蛋白（注：离心后样品分为三层，上层为脂质层，下层为蛋白沉淀，中间层为乳清。离心后上层状态为致密、稳定、不易脱落，若上层松软、易脱落且下层沉淀较多，可重复此步骤，每次离心取中间层液体）；

 10 cm 有效离心半径的大离心机换算（≥15 mL 离心管），下同。

4、乳清转移： 将去除脂质的乳清（中间层液体） 转移至新的 50 mL 离心管中（注：可用枪头将上层脂质戳破后缓慢倾倒，或用移液器转移， 转移后的乳清中带有少量脂质和沉淀是正常现象， 不影响后续实验）。

二、 去除杂蛋白

1、乳清澄清：乳清中加入 Solution A，将 离心管颠倒混匀至呈现半透明状，再加入 Solution B，颠倒混匀后于 2℃ 至 8℃ 静置 10 min（注：静置完成后轻轻晃动离心管，呈现豆花状固体，液体部分为透明状。 若未呈现豆花状或样品仍为乳白色，可再适当加入 Solution B 至液体为透明状）。

乳清体积	Solution A 剂量	Solution B 剂量
20 mL	2 mL	2.5 mL

注： 具体加入剂量请根据上表等比例换算

2、离心去蛋白：将澄清后的乳清于 4℃ 以 10,000 ×g（~9,500 rpm）离心 10 min ，收集上清液；

3、上清液过滤：将收集的上清液转移至 50 mL 离心过滤柱中，于 4℃ 以 5200 rpm（~3000 ×g）离心 2 min（注： 若未过滤完全， 可重复此步骤。50 mL 离心过滤柱为一次性耗材，不建议重复使用）；

4、将过滤后的上清液转移至新离心管中，加入 Solution C 后颠倒混匀（注：Solution C 加入剂量和 Solution B 剂量保持一致）。

三、 提取外泌体

1、上清液预处理：在加入 Solution C 后的上清液中加入 Solution D，具体加入剂量如下：

样品剂量	加入 Solution D 剂量
20 mL	5 mL

注：其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

2、溶液混合：加入 Solution D 后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1 min，再放置于 4℃ 静置至少 1 h（注： 增加静置时间可提高外泌体得率，但静置时间不可超过 24 h）；

3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10,000 ×g（~9,500 rpm）离心 60 min，弃上清， 沉淀中富含外泌体颗粒（注：尽可能吸净上清液）;

4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4℃ 以 10,000 ×g（~9,500 rpm）离心 2 min，弃上清（注：尽可能吸尽上清液）；

5、外泌体重悬：取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中（建议每 25 mL 乳液用 200 μL 左右 1×PBS 重悬）；

6、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 2 min，保留上清液，其中富含外泌体颗粒（注：若沉淀较多，可 12,000 ×g，2 min 离心多次至无明显沉淀，每次取上清液，外泌体溶液可能带有淡淡的乳白色，此为正常现象）。

 7 cm 有效离心半径的小离心机换算（≤2 mL 离心管）。

7、外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后续实验使用。