外泌体提取纯化（尿液）

高速离心机（可达到 10000g 离心力），涡旋振荡器；50mL 离心转子， 1.5mL 离心管；

试剂盒组分：

组分名称	规 格
Exosome Concentration Solution	100mL
Exosome Solution Buffer	20mL
50mL 离心过滤柱	20 个

一、样品预处理

1. 取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

2. 样品初始用量：

样品名称	最低量
尿液	25mL

3. 离心去细胞碎片：将样品转移至离心管中，于 4℃ 以 3000g 离心 10min，去除样品中的细胞碎片；（注：若沉淀较多，可 3000g/10min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）

4. 上清液转移：去除细胞碎片的离心上清液转移到 50mL 离心过滤柱中；

5. 样本过滤：将 50mL 离心过滤柱转至高速离心机中，于 4℃ 以 3000g 离心 10 min，取过滤柱下室液体。（注：若上室中有残留液体，可重复本步骤以获得更多样本量）

二、提取外泌体

1. 上清液预处理：在离心过滤后的上清液中加入 Exosome Concentration Solution（ECS 试剂），具体的加入剂量如下：（其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算）

样品名称	样品剂量	加入 ECS 剂量
尿液	25mL	5mL

2. 溶液混合：加入 ECS 试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1min，再放置于 4℃ 静置 2h；

3. 沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10000g 离心 60min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）

4. 外泌体重悬：取 Exosome Solution Buffer（ESB 试剂）均匀吹打离心沉淀物（具体加入剂量如下表），待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5mL 离心管中；

尿液样品体积	加入 ESB 剂量
25mL	0.5mL

注：其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

5. 收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5mL 离心管于 4℃ 以 12000g 离心 5min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。

6. 外泌体的保存：保存于 -80℃ 低温冰箱中，以备使用。若样品量较多，建议分装后保存。