「外泌体 + 环状 RNA」国自然双热点助力肿瘤研究发表高分文章
和元生物
结直肠癌（CRC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，具有很高的转移和复发风险。由于传统疗法存在毒性、不耐受等缺点，临床结果不能令人满意。因此，迫切需要识别出敏感的CRC 标记物，作为早期检测和治疗的新靶点。近年来，外泌体在癌症中的作用越来越受到关注。
在本篇文章中，上海同济大学医学院李冬教授和孙祖俊教授等[1]首次揭示了癌症来源的外泌体 circPACRGL 在 CRC 增殖和转移中起致癌作用，并为 CRC 治疗提供了有价值的标志物。研究结果如下：
1.CRC 来源的外泌体能促进 CRC 的增殖、迁移和侵袭
作者从两种 CRC 细胞系（HCT116和SW480）上清中分别分离获得外泌体，经过透射电镜、NTA 和 WB 鉴定后，确认已分离出外泌体。随后，作者用外泌体处理对应的 CRC 细胞，发现外泌体能显著促进 CRC 细胞增殖、迁移和侵袭，并减少凋亡。
WB 结果也显示，外泌体能提升 CRC 细胞中 BCL-2、 N-cadherin、Vimentin、MMP9 蛋白水平，和降低 E-cadherin、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9 蛋白水平。裸鼠成瘤的结果表明，外泌体处理能明显增加 HCT116 细胞的转移（Fig.1）。
Fig.1 CRC 来源的外泌体能促进 CRC 的增殖、迁移和侵袭
2. circPACRGL 在添加了肿瘤来源外泌体的 CRC 细胞中显著上调
作者接着分别用外泌体处理了 HCT116 和 SW480，收集了 Ex-HCT116 和 Ex-SW480 细胞样本，再用未处理组做对照，进行了 RNA 二代测序。结果发现，circPACRG 在 Ex-HCT116和 Ex-SW480 两组细胞中显著上调，再用 RT-PCR 验证了趋势是一致的。但是，作者用CRC 病人血清来源的外泌体去处理 CRC，得到的结果和上述细胞中趋势不一致，推测circPACRGL 在血清外泌体中的表达差异可能与肿瘤组织特异性和患者背景有关。
作者进一步分离了 CRC 病人的肿瘤组织外泌体，qRT-PCR 结果显示 circPACRGL 的表达在用肿瘤来源的外泌体（Tumor-EXO）处理的 CRC 细胞中显著上调。这些结果表明 circPACRGL 在受肿瘤来源外泌体刺激的 CRC 细胞中显着增加，并且 circPACRGL 可能来源于肿瘤来源的外泌体（Fig.2）。
Fig.2 circPACRGL 在添加了肿瘤来源外泌体的 CRC 细胞中显著上调
3. circPACRGL 发挥 miR-142-3p 和 miR-506-3p 的海绵作用
荧光原位杂交（FISH）结果显示，circPACRGL 转录信号主要分布在 HCT116 和 SW480 细胞的细胞质中，少数在细胞核中。作者通过在线预测，发现 circPACRGL同时具有miR-142-3p 和 miR-506-3p 的结合位点。
双萤光素酶报告检测进一步证实 miR-142-3p 和 miR-506-3p 是 circPACRGL 的靶点。此外，作者发现在 CRC 来源外泌体刺激的 HCT116 和SW480 细胞中 miR-142-3p 和 miR-506-3p 表达均显著降低（Fig.3）。
Fig.3 circPACRGL发挥miR-142-3p和miR-506-3p的海绵作用
4.TGF-β1 是 miR-142-3p/miR-506-3p 的共同靶点
作者通过在线工具预测，找到了 TGF-β1 是 miR-142-3p 和 miR-506-3p 的一个最佳共同靶点。接着作者通过萤光素酶报告检测、WB、qRT-PCR、miR-142-3p/miR-506-3p inhibitor 等一系列实验验证了这一推测，即 TGF-β1 是 mir -142-3p 和 miR-506-3p 的共同靶点（Fig.4）。
Fig.4 TGF-β1 是 miR-142-3p/miR-506-3p 的共同靶点的发展。
5. circPACRGL 通过调控 miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1 轴促进 CRC 增殖、迁移和侵袭
作者推测 circPACRGL 可能通过 miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1 轴调控 CRC 的增殖、迁移和侵袭。于是作者设置了不同的实验调控条件，即 CRC 来源的外泌体处理、circPACRGL 敲低、miR-142-3p inhibitor 处理、miR-506-3p inhibitor 处理、TGF-β1 过表达等，分别对细胞进行分组检测，观察不同组别的细胞增殖、迁移和侵袭变化。
作者的数据表明 circPACRGL 通过调控 miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1 轴促进了 CRC 的增殖、迁移和侵袭（Fig.5）。
Fig.5 circPACRGL通过调控miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1轴促进CRC增殖、迁移和侵袭
6. CRC 来源的外泌体 circPACRGL 通过 miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1 轴调节 N1-N2 中性粒细胞的分化
有报道称，高水平的 TGF-β1 与肿瘤的发生发展及 N1 向 N2 中性粒细胞表型转换有关。作者通过流式细胞术检测上述不同组别中 N2 中性粒细胞的比例。结果表明，CRC 来源的外泌体 circPACRGL 可以通过 miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 调节中性粒细细胞的 N1-N2 分化（Fig.6）。
Fig.6 circPACRGL 通过 miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1 轴调控 N1-N2 中性粒细胞在小鼠结肠癌细胞中的分化（CT-26）
结论
本文揭示了肿瘤来源的外泌体可以携带 circRNAs 进入肿瘤中性粒细胞，并通过海绵吸收 miRNAs 调控 TGF-β 的表达，进而促进中性粒细胞由 N1 型向 N2 型转化，最终导致肿瘤的发生发展。因此，本研究表明，circPACRGL-miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1 轴可能是一种很有前景的 CRC 治疗策略。
Fig.7 图示概括了 circPACRGL 通过 miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1 轴调控 N1-N2中性粒细胞在癌症进展中的分化的发展。
参考文献：
